Циклическая амплификация неправильного сворачивания белка
Циклическая амплификация с неправильной укладкой белка ( PMCA ) — это метод амплификации (концептуально похожий на полимеразную цепную реакцию (ПЦР), но без участия нуклеотидов ) для умножения неправильно свернутых прионов, первоначально разработанный Сото и его коллегами. [1] Это тест на губкообразные энцефалопатии , такие как хроническая истощающая болезнь (ХИЗ). [2] или бычья губчатая энцефалопатия (ГЭКРС).
Техника
[ редактировать ]Этот метод первоначально инкубирует небольшое количество аномального приона с избытком нормального белка, так что происходит некоторая конверсия. Растущая цепь неправильно свернутого белка затем подвергается воздействию ультразвука , разбивая ее на более мелкие цепи и быстро увеличивая количество аномального белка, доступного для превращения. [1] [3] Повторяя цикл, масса нормального белка быстро превращается в тестируемый прион. [ нужна ссылка ]
Разработка
[ редактировать ]Первоначально PMCA был разработан для имитации репликации прионов in vitro с эффективностью, аналогичной процессу in vivo , но с ускоренной кинетикой. [1] PMCA концептуально аналогичен полимеразной цепной реакции - в обеих системах матрица растет за счет субстрата в циклической реакции, сочетающей рост и размножение единиц матрицы. [ нужна ссылка ]
Репликация
[ редактировать ]PMCA применялся для репликации неправильно свернутого белка у различных видов. [4] [5] [6] Вновь созданный белок демонстрирует те же биохимические, биологические и структурные свойства, что и PrP, полученный из мозга. наук И что поразительно, он заразен для животных дикого типа , вызывая заболевание с теми же характеристиками, что и заболевание, вызываемое прионами, выделенными из мозга. [7]
Автоматизация
[ редактировать ]Технология была автоматизирована, что привело к резкому увеличению эффективности усиления. Теперь один цикл приводит к увеличению чувствительности обнаружения в 2500 раз по сравнению с вестерн-блоттингом. [8] тогда как 2 и 7 последовательных циклов приводят к увеличению чувствительности обнаружения в 6 миллионов и 3 миллиардов раз по сравнению с вестерн-блоттингом , методом, широко используемым при надзоре за ГЭКРС в нескольких странах. [8]
Чувствительность
[ редактировать ]Было показано, что PMCA способен обнаруживать всего лишь одну молекулу олигомерного инфекционного PrP. наук . [8] PMCA обладает способностью генерировать миллионы инфекционных единиц, начиная с эквивалента одного PrP. наук олигомер; значительно ниже порога заразности . [8] Эти данные демонстрируют, что PMCA обладает такой же силой амплификации, как и методы ПЦР, используемые для амплификации ДНК. Это открывает большие перспективы для разработки высокочувствительного метода обнаружения PrP. наук и для понимания молекулярных основ репликации прионов. Действительно, PMCA использовалась различными группами для PrP. наук в крови животных, экспериментально зараженных прионами, в течение как симптоматического [9] и предсимптоматические фазы [10] так и в моче. [11]
Использование
[ редактировать ]Технология PMCA использовалась несколькими группами для понимания молекулярного механизма репликации прионов, природы инфекционного агента, феномена прионных штаммов и видового барьера, влияния клеточных компонентов, для обнаружения PrP. наук в тканях и биологических жидкостях, а также для выявления ингибиторов репликации прионов. [12] [13] [14] Недавние исследования групп Супаттапона и Ма смогли обеспечить репликацию приона in vitro с помощью PMCA с использованием очищенного PrP. С и рекомбинантный PrP С с единственным добавлением синтетических полианионов и липидов . [15] [16] Эти исследования показали, что инфекционные прионы могут вырабатываться в отсутствие каких-либо других клеточных компонентов, и представляют собой одно из наиболее убедительных доказательств в пользу прионной гипотезы.
Исследования 2020 года пришли к выводу, что циклическая амплификация неправильного сворачивания белков может использоваться для различения двух прогрессирующих нейродегенеративных заболеваний, болезни Паркинсона и множественной системной атрофии , что является первым процессом, позволяющим поставить объективный диагноз множественной системной атрофии, а не просто дифференциальный диагноз. [17] [18]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с Саборио Г.П., Перманн Б. и Сото К. (2001)Чувствительное обнаружение патологического прионного белка путем циклической амплификации неправильного сворачивания белка. Природа, 411, 810–813.
- ^ Патрис Н. Кляйн, менеджер программы CWD USDA/APHIS. «Хроническая изнуряющая болезнь — предложенное APHIS правило для приведения правил импорта ГЭКРС в соответствие с МЭБ» (PDF) . Заседание WHHCC – 5–6 февраля 2013 г. Архивировано из оригинала (PDF) 26 сентября 2014 г.
{{cite web}}: CS1 maint: местоположение ( ссылка ) - ^ Сото К., Саборио Г. П. и Андерес Л. (2002) Циклическая амплификация неправильного сворачивания белка: применение к прионным расстройствам и за его пределами. Тенденции Неврологии., 25, 390-394.
- ^ Сото, К., Андерес, Л., Суарди, С., Кардоне, Ф., Кастилья, Дж., Фроссар, М.Дж., Пеано, С., Саа, П., Лимидо, Л., Карбонатто, М., Айронсайд Дж., Торрес Дж. М., Поккиари М. и Тальявини Ф. (2005)Пресимптоматическое обнаружение прионов путем циклической амплификации неправильного сворачивания белка. Письмо ФЕБС, 579, 638-642.
- ^ Джонс, М., Педен, А.Х., Проуз, К.В., Гронер, А., Мэнсон, Дж.К., Тернер, М.Л., Айронсайд, Дж.В., МакГрегор, И.Р. и Хед, М.В. (2007) Амплификация in vitro и обнаружение варианта Крейцфельдта – Болезнь Якоба PrPSc. Дж.Патол., 213, 21-26.
- ^ Курт, Т.Д., Перротт, М.Р., Вилуш, К.Дж., Вилуш, Дж., Супаттапоне, С., Теллинг, Г.К., Забель, М.Д. и Гувер, Э.А. (2007)Эффективное усиление in vitro хронической истощающей болезни PrPRES. Дж.Вирол., 81, 9605-9608.
- ^ Кастилья, Дж., Саа, П., Хец, К. и Сото, К. (2005) Получение in vitro инфекционных прионов скрепи. Ячейка, 121, 195-206.
- ^ Перейти обратно: а б с д Саа П., Кастилья Дж. и Сото К. (2006)Сверхэффективная репликация инфекционных прионов путем автоматической циклической амплификации неправильного сворачивания белков. J.Biol.Chem., 281, 35245-35252.
- ^ Кастилья Дж., Саа П. и Сото К. (2005) Обнаружение прионов в крови. Nat.Med., 11, 982-985.
- ^ Саа, П., Кастилья, Дж. и Сото, К. (2006) Предсимптомное обнаружение прионов в крови. Наука, 313, 92–94.
- ^ Гонсалес-Ромеро, Д., Барриа, М.А., Леон, П., Моралес, Р. и Сото, К. (2008) Обнаружение инфекционных прионов в моче. Письмо ФЕБС, 582, 3161-3166.
- ^ Кастилья, Дж., Гонсалес-Ромеро, Д., Саа, П., Моралес, Р., Де, С.Дж. и Сото, К. (2008). Преодоление видового барьера путем репликации PrP (Sc) in vitro генерирует уникальные инфекционные прионы. . Ячейка, 134, 757-768.
- ^ Барриа, Массачусетс, Мукерджи, А., Гонсалес-Ромеро, Д., Моралес, Р. и Сото, К. (2009) Генерация инфекционных прионов de novo in vitro приводит к новому фенотипу заболевания. ПЛоС.Патог., 5, е1000421.
- ^ Делео, Н.Р., Лукассен, Р.В. и Супаттапоне, С. (2003) Молекулы РНК стимулируют конверсию прионного белка. Природа, 425, 717–720.
- ^ Делео, Н.Р., Харрис, Б.Т., Рис, Дж.Р. и Супаттапоне, С. (2007) Образование нативных прионов из минимальных компонентов in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 104, 9741-9746.
- ^ Ван, Ф., Ван, X., Юань, К.-Г. и Ма, Дж. (2010) Получение приона с помощью бактериально экспрессируемого рекомбинантного прионного белка. Наука 327, 1132–1135.
- ^ «Метод позволяет отличить болезнь Паркинсона от множественной системной атрофии» . Диагностика от технологических сетей . Проверено 23 февраля 2020 г.
- ^ Шахнаваз, Мохаммед; Мукерджи, Абхисек; Прицков, Сандра; Мендес, Николас; Рабадия, Пракрути; Лю, Сянган; Ху, Бо; Шмейхель, Энн; Певец, Вольфганг; Ву, Банда; Цай, Ах-Лим; Ширани, Хамид; Нильссон, К. Питер Р.; Лоу, Филипп А.; Сото, Клаудио (5 февраля 2020 г.). «Дискриминация штаммов α-синуклеина при болезни Паркинсона и множественной системной атрофии» . Природа . 578 (7794): 273–277. Бибкод : 2020Natur.578..273S . дои : 10.1038/s41586-020-1984-7 . ПМК 7066875 . ПМИД 32025029 .