Ядерное продолжение
Ядерный анализ проводится для идентификации генов , которые транскрибируются в определенный момент времени. Приблизительно один миллион ядер клеток изолируется и инкубируется с мечеными нуклеотидами , а гены, находящиеся в процессе транскрипции, обнаруживаются путем гибридизации выделенной РНК с ген-специфичными зондами на блоттинге . [1] Гарсия-Мартинес и др. (2004) [2] разработали протокол для дрожжей S. cerevisiae (Genomic run-on, GRO), который позволяет рассчитывать скорости транскрипции (TR) для всех генов дрожжей для оценки стабильности мРНК для всех мРНК дрожжей. [3]
Недавно были разработаны альтернативные методы микрочипа, в основном RIP-чип PolII: иммунопреципитация РНК РНК-полимеразы II с фосфорилированными антителами, направленными на С-концевой домен, и гибридизация на предметном стекле или чипе микрочипа (слово «чип» в названии происходит от «ChIP-чип»). специальный генный чип Affymetrix где требовался ). Сравнение методов, основанных на run-on и ChIP-чипе, было проведено на дрожжах (Pelechano et al., 2009). Было обнаружено общее соответствие обоих методов, но GRO является более чувствительным и количественным. Следует учитывать, что run-on обнаруживает только удлиненные РНК-полимеразы, тогда как ChIP-чип обнаруживает все присутствующие РНК-полимеразы, включая обратные.
Присоединение новой РНК-полимеразы к генам предотвращается включением саркозила . Следовательно, только гены, уже имеющие РНК-полимеразу, будут производить меченые транскрипты. Транскрипты РНК, синтезированные до добавления метки, не будут обнаружены, поскольку у них нет метки. Их также можно обнаружить путем очистки меченых транскриптов с помощью антител, которые обнаруживают метку, и гибридизации этих изолированных транскриптов с массивами экспрессии генов или с помощью секвенирования следующего поколения (GRO-Seq). [4]
Анализы Run on были в значительной степени вытеснены анализами Global Run on, которые используют секвенирование ДНК нового поколения в качестве платформы для считывания. Эти анализы известны как GRO-Seq и дают невероятно подробное представление о генах, участвующих в транскрипции, с количественными уровнями экспрессии. Методы анализа на основе матриц для анализа Global run on (GRO) заменяются секвенированием следующего поколения, которое исключает разработку зондов для проверки последовательностей генов. Секвенирование каталогизирует все полученные транскрипты, даже если они не указаны в базах данных. GRO-seq включает мечение вновь синтезированных транскриптов бромуридином (BrU). Клетки или ядра инкубируют с BrUTP в присутствии саркозила , который предотвращает прикрепление РНК-полимеразы к ДНК. Следовательно, только РНК-полимераза, которая уже присутствовала в ДНК до добавления саркозила, будет производить новые транскрипты, которые будут помечены BrU. Меченые транскрипты захватываются шариками, меченными антителами против BrU, конвертируются в кДНК и затем секвенируются с помощью секвенирования ДНК следующего поколения. Затем считывания секвенирования выравниваются по геному, и количество чтений на транскрипт дает точную оценку количества синтезированных транскриптов. [5]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Гарильо, П; Беллард, М; Шамбон, П. (июнь 1981 г.). «Кластеризация молекул РНК-полимеразы B в 5'-части взрослого гена бета-глобина эритроцитов» . Нуклеиновые кислоты Рез . 9 (11): 2589–98. дои : 10.1093/нар/9.11.2589 . ПМК 326874 . ПМИД 6269056 .
- ^ Гарсиа-Мартинес, Дж; Аранда, А; Перес-Ортин, Дж. Э. (2004). «Геномный анализ оценивает скорость транскрипции всех генов дрожжей и определяет механизмы регуляции генов». Мол. Клетка . 15 (2): 303–13. doi : 10.1016/j.molcel.2004.06.004 . HDL : 10550/32058 . ПМИД 15260981 .
- ^ Пелечано, В; Химено-Гонсалес, С; Родригес-Хиль, А; Гарсиа-Мартинес, Дж; Перес-Ортин, JE; Чавес, С. (август 2009 г.). «Регулон-специфический контроль элонгации транскрипции в геноме дрожжей» . ПЛОС Генет . 5 (8): e1000614. дои : 10.1371/journal.pgen.1000614 . ПМК 2721418 . ПМИД 19696888 .
- ^ Ядро, Л; Водопад, Дж; Лис, Джей Ти (2008). «Секвенирование зарождающейся РНК показывает широко распространенную паузу и дивергентную инициацию в человеческих промоутерах» . Наука . 322 (5909): 1845–8. Бибкод : 2008Sci...322.1845C . дои : 10.1126/science.1162228 . ПМЦ 2833333 . ПМИД 19056941 .
- ^ Мин, ИМ; Водопад, Джей-Джей; Кор, ЖЖ; Манро, Р.Дж.; Скименти, Дж; Лис, JT (апрель 2011 г.). «Регулирование паузы РНК-полимеразы и элонгации транскрипции в эмбриональных стволовых клетках» . Генс Дев . 25 (7): 742–54. дои : 10.1101/gad.2005511 . ПМК 3070936 . ПМИД 21460038 .