Электрофоретический цветной маркер
Электрофоретический цветной маркер — это химическое вещество, используемое для мониторинга хода электрофореза в агарозном геле и электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), поскольку ДНК, РНК и большинство белков бесцветны. [ 1 ] Цветные маркеры состоят из смеси красителей , которые мигрируют через матрицу геля вместе с интересующим образцом. Обычно они рассчитаны на подвижность, отличающуюся от подвижностей компонентов пробы, и создают цветные полосы, которые можно использовать для оценки миграции и разделения компонентов пробы. [ 2 ]
Цветные маркеры часто используются в качестве стандартов молекулярной массы, красителей для загрузки, следящих красителей или растворов для окрашивания. Лестницы молекулярной массы используются для оценки размера фрагментов ДНК и белка путем сравнения расстояния их миграции с расстоянием миграции цветных полос. [ 2 ] Стандарты ДНК и белка коммерчески доступны в широком диапазоне размеров и часто снабжены предварительно окрашенными или имеющими цветовую маркировку полосами для облегчения идентификации. Загрузочные красители обычно добавляются в буфер для образца перед загрузкой образца в гель, и они мигрируют через гель вместе с образцом, чтобы помочь отслеживать его прогресс во время электрофореза. [ 3 ] Следящие красители добавляются в буфер для электрофореза скорее для того, чтобы обеспечить визуальный маркер фронта буфера. Окрашивающие растворы наносятся после электрофореза для визуализации полос образца и доступны в различных цветах.
В продаже доступны различные типы электрофоретических цветных маркеров с разным количеством и типами красителей или пигментов, используемых в смеси. Некоторые маркеры создают серию цветных полос с известной подвижностью, тогда как другие создают одну полосу определенного цвета, которую можно использовать в качестве ориентира. Они широко используются в научных исследованиях, клинической диагностике и судебной медицине . [ 4 ]
Маркеры прогресса
[ редактировать ]Загрузочные буферы часто содержат анионные красители, видимые в видимом спектре света, и добавляются в гель перед нуклеиновой кислотой. Следящие красители не должны быть реактивными, чтобы не изменять образец и не перемещаться по гелю вместе с образцом ДНК или РНК. [ 5 ] Обычно используемые цветные маркеры включают бромфеноловый синий , крезоловый красный , оранжевый G и ксилолцианол . Ксилол и бромфеноловый синий являются наиболее часто используемыми красителями. [ нужна ссылка ] Вообще говоря, оранжевый G мигрирует быстрее, чем бромфеноловый синий, который мигрирует быстрее, чем ксилолцианол, но видимые «размеры» этих красителей (по сравнению с молекулами ДНК) варьируются в зависимости от концентрации агарозы и используемой буферной системы. Например, в 1% агарозном геле, приготовленном в буфере ТАЕ ( Трис - ацетат - ЭДТА ), ксилолцианол мигрирует со скоростью молекулы ДНК длиной 3000 пар оснований (п.н.), а бромфеноловый синий мигрирует со скоростью 400 п.о. Однако в 1% геле, приготовленном в буфере ТВЕ (Трисборат - ЭДТА), они мигрируют со скоростью 2000 п.н. и 250 п.н. соответственно. [ 3 ]
Окрашивание ДНК и РНК
[ редактировать ]Электрофорез в агарозном геле — это метод, широко используемый для оценки размера фрагментов нуклеиновых кислот и их идентификации на основе их дифференциальной подвижности в геле. Нуклеиновые кислоты обычно окрашивают и обнаруживают с помощью бромистого этидия или красителей SYBR Green. [ нужна ссылка ] Наиболее распространенным электрофоретическим пятном в агарозном геле является бромид этидия, однако SYBR green обеспечивает более высокое разрешение и выход при обнаружении одноцепочечных нуклеиновых кислот. [ нужна ссылка ] Красители обеспечивают флуоресценцию ДНК и РНК в УФ-свете с длиной волны 300 нм. Это происходит из-за их интеркалирующей природы. В двуспиральных нуклеиновых кислотах красители связываются между двумя цепями, а в одноцепочечных нуклеиновых кислотах красители связывают короткие дуплексные сегменты, образованные внутри цепи. [ нужна ссылка ]
Наиболее часто используемым красителем для электрофореза ДНК и РНК в агарозном геле, начиная с 1970-х годов, является бромид этидия (2,7-диамино-10-этил-9-фенилфенантридинийбромид). [ нужна ссылка ] Бромид этидия (EtBr) — флуоресцентный интеркалирующий краситель оранжевого цвета. Краситель внедряется между двойной спиральной структурой нуклеиновых кислот, позволяя визуализировать молекулы в УФ-свете. [ 6 ] EtBr имеет максимумы поглощения при 300–360 нм и максимумы флуоресцентной эмиссии при 500–590 нм с пределом обнаружения 0,5–5,0 нг/полосу. [ 6 ] Однако краситель имеет пониженную чувствительность при обнаружении образцов одноцепочечных нуклеиновых кислот. С EtBr следует обращаться осторожно, поскольку он является сильным мутагеном. [ 6 ]
Более чувствительной альтернативой окрашиванию нуклеиновых кислот при гель-электрофорезе является SYBR™ Green I. [ 7 ] Краситель в 25 раз более чувствителен, чем EtBr, при окрашивании дцДНК и особенно полезен в анализах окрашивания, содержащих одноцепочечные нуклеиновые кислоты. [ нужна ссылка ] Однако SYBR Green дороже по сравнению с EtBr.
Окрашивание белков
[ редактировать ]Кумасси синий является наиболее часто используемым нековалентным красителем при электрофорезе в полиакриламидном геле с ДСН для количественного определения белка. Окрашивающий краситель связывается с полосами белка и создает синий цвет, который можно обнаружить визуально. Кумасси бриллиантовый синий R-250 (красный) обычно используется для электрофореза, а кумасси бриллиантовый синий G-250 (зеленый) - для анализа Брэдфорда. [ 8 ] Ограничением этого красителя является то, что он неспецифичен, связывается практически с любым белком в растворе и менее чувствителен. [ нужна ссылка ] Другим распространенным методом визуализации белков в геле является окрашивание серебром, при котором растворимые ионы серебра навсегда маркируют белки и восстанавливаются формальдегидом с образованием коричневого осадка. [ нужна ссылка ] Окрашивание серебром является более чувствительным методом окрашивания по сравнению с кумасси синим, однако результаты более уязвимы к загрязнению.
Приложения
[ редактировать ]Цветные маркеры иногда добавляют к красителям для гель-электрофореза при разделении фрагментов ДНК. Загрузочные красители удерживают образцы ДНК под поверхностью агарозного геля, а цветные маркеры внутри помогают отслеживать фронт миграции ДНК по мере ее движения по гелю. [ 9 ]
Для PAGE некоторые коммерчески доступные маркеры молекулярной массы (также называемые «лестницами», потому что после разделения они выглядят как ступеньки лестницы) содержат предварительно окрашенные белки разных цветов, поэтому можно более точно определить, где находятся интересующие белки в образцы могут быть.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ «Продукция: Цветные маркеры для электрофореза». Наука . 277 (5328): 979. 15 августа 1997 г. дои : 10.1126/science.277.5328.979 . ISSN 0036-8075 .
- ^ Перейти обратно: а б Бубис Дж. (май 2021 г.). «Предложение лабораторного курса, посвященного созданию стандартов молекулярной массы белков для электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия». Образование в области биохимии и молекулярной биологии . 49 (3): 353–360. дои : 10.1002/bmb.21476 . ПМИД 33301651 . S2CID 228101616 .
- ^ Перейти обратно: а б Кепплер-Росс С., Ноффз С., Дин Н. (май 2008 г.). «Новый фиолетовый флуоресцентный маркер для генетических исследований Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans» . Генетика . 179 (1): 705–710. doi : 10.1534/genetics.108.087080 . ПМК 2390648 . ПМИД 18493083 .
- ^ Видеркер Ф., Имфельд Х., Вондершмитт DJ (декабрь 1986 г.). «Двумерный гель-электрофорез, изоэлектрофокусирование и электрофорез в агарозном геле в диагностике рассеянного склероза» . Журнал клинической химии и клинической биохимии. Журнал клинической химии и клинической биохимии . 24 (12): 1017–1021. дои : 10.1515/cclm.1986.24.12.1017 . ПМИД 3819655 . S2CID 11465370 .
- ^ Хойл М.Г. (6 августа 2018 г.). «Лабораторные процедуры гель-электрофореза» . Наука . Проверено 11 мая 2023 г.
- ^ Перейти обратно: а б с «Бромид этидия – США» . www.thermofisher.com . Проверено 11 мая 2023 г.
- ^ «SYBR™ Green I Окраска геля нуклеиновых кислот — 10 000-кратный концентрат в ДМСО» . www.thermofisher.com . Проверено 11 мая 2023 г.
- ^ Шевалье Ф (октябрь 2010 г.). «Стандартные красители для окрашивания общего белка при протеомном анализе на основе геля» . Материалы . 3 (10): 4784–4792. Бибкод : 2010Mate....3.4784C . дои : 10.3390/ma3104784 . ПМЦ 5445784 . ПМИД 28883353 .
- ^ Ли П.Ю., Костумбрадо Дж., Сюй С.И., Ким Ю.Х. (апрель 2012 г.). «Электрофорез в агарозном геле для разделения фрагментов ДНК» . Журнал визуализированных экспериментов . 62 (62). дои : 10.3791/3923 . ПМЦ 4846332 . ПМИД 22546956 .