Гипотеза бессмертной цепи ДНК

Гипотеза бессмертной цепи ДНК была предложена в 1975 году Джоном Кернсом как механизм, позволяющий взрослым стволовым клеткам минимизировать мутации в их геномах . Эта гипотеза предполагает, что вместо случайного разделения своей ДНК во время митоза взрослые стволовые клетки делят свою ДНК асимметрично и сохраняют отдельный матричный набор нитей ДНК (родительские нити) в каждом делении. Сохраняя тот же набор цепей матричной ДНК, взрослые стволовые клетки будут передавать мутации, возникающие из-за ошибок репликации ДНК , дочерним клеткам, не являющимся стволовыми, которые вскоре окончательно дифференцируются (завершают митотические деления и становятся функциональной клеткой). Передача этих ошибок репликации позволит взрослым стволовым клеткам снизить скорость накопления мутаций, которые могут привести к серьезным генетическим нарушениям, таким как рак .

Хотя доказательства этого механизма существуют, до сих пор остается спорным вопрос о том, действует ли этот механизм на взрослые стволовые клетки in vivo .

Методы

два основных анализа Для обнаружения сегрегации иммортализованной цепи ДНК используются : анализы удержания метки и импульсного/преследующего высвобождения метки.

Целью анализа удержания метки является маркировка «бессмертных» или родительских цепей ДНК с помощью ДНК-метки, такой как тритированный тимидин или бромдезоксиуридин (BrdU). Эти типы меток ДНК будут включаться во вновь синтезированную ДНК делящихся клеток во время S-фазы . Импульс метки ДНК подается взрослым стволовым клеткам в условиях, когда они еще не сформировали бессмертную цепь ДНК. В этих условиях взрослые стволовые клетки либо делятся симметрично (таким образом, при каждом делении определяется новая «бессмертная» цепь, и по крайней мере в одной из стволовых клеток бессмертная цепь ДНК будет отмечена меткой ДНК), либо взрослый стволовой клетки клетки еще не определены (таким образом, их предшественники делятся симметрично, и как только они дифференцируются во взрослые стволовые клетки и выбирают «бессмертную» цепь, «бессмертная цепь» уже будет отмечена). Экспериментально взрослые стволовые клетки подвергаются симметричным делениям во время роста и после заживления ран и еще не определены на неонатальных стадиях. Как только бессмертная цепь ДНК помечена и взрослая стволовая клетка начала или возобновила асимметричные деления, метка ДНК вытесняется. В симметричных подразделениях (большинство митотических клетках), ДНК распределяется случайным образом, и после пяти делений метка ДНК будет разбавлена ​​до уровня ниже обнаружения. Однако если клетки используют механизм бессмертной цепи ДНК, то вся меченая ДНК будет продолжать сегрегировать вместе со взрослой стволовой клеткой и после пяти (или более) делений все равно будет обнаруживаться внутри взрослой стволовой клетки. Эти клетки иногда называют клетками, сохраняющими метку (LRC).

Целью анализа высвобождения метки является маркировка вновь синтезированной ДНК, которая обычно передается дочерней (нестволовой) клетке. Импульс ДНК-метки передается взрослым стволовым клеткам в условиях, когда они делятся асимметрично. В условиях гомеостаза взрослые стволовые клетки должны делиться асимметрично, чтобы в тканевом компартменте сохранялось одинаковое количество взрослых стволовых клеток. После достаточно долгого импульсного воздействия, чтобы пометить всю вновь реплицированную ДНК, метка ДНК удаляется (теперь каждая репликация ДНК включает немеченые нуклеотиды), а взрослые стволовые клетки анализируются на предмет потери метки ДНК после двух клеточных делений. Если клетки используют механизм случайной сегрегации, то в клетке должно остаться достаточно метки ДНК, чтобы ее можно было обнаружить. Однако если взрослые стволовые клетки используют механизм бессмертной цепи ДНК, они обязаны сохранять немеченую «бессмертную» ДНК и высвобождать всю вновь синтезированную меченую ДНК своим дифференцирующимся дочерним клеткам в двух делениях.

Некоторые учёные объединили эти два подхода. сначала используя одну метку ДНК для маркировки бессмертных нитей, что позволяет взрослым стволовым клеткам начать асимметрично делиться, а затем используя другую метку ДНК для маркировки вновь синтезированной ДНК. Таким образом, взрослые стволовые клетки сохранят одну метку ДНК и высвободят другую в течение двух делений.

Доказательство

Доказательства гипотезы бессмертной цепи ДНК были найдены в различных системах. Одно из самых ранних исследований Карла Ларка и др. продемонстрировали сегрегацию ДНК в клетках кончиков корней растений. Кончики корней растений, меченные тритиевым тимидином, имели тенденцию отдавать меченную ДНК в одну и ту же дочернюю клетку. Хотя не вся меченая ДНК перешла к одной и той же дочери, количество меченной тимидином ДНК, наблюдаемое у дочери с меньшим количеством метки, соответствовало количеству, которое могло бы возникнуть в результате обмена сестринских хроматид. Более поздние исследования Кристофера Поттена и др. (2002), Используя эксперименты «импульс/погоня» с тритиевым тимидином, обнаружили долговременно удерживающие метку клетки в криптах тонкого кишечника новорожденных мышей. Эти исследователи выдвинули гипотезу, что длительное включение тритированного тимидина происходит потому, что у новорожденных мышей неразвит тонкий кишечник, и что импульсное введение тритированного тимидина вскоре после рождения мышей позволяет пометить «бессмертную» ДНК взрослых стволовых клеток во время их формирования. Было продемонстрировано, что эти долговременные клетки активно участвуют в цикле, о чем свидетельствует включение и высвобождение BrdU.

Поскольку эти клетки совершали циклический цикл, но продолжали содержать метку BrdU в своей ДНК, исследователи пришли к выводу, что они, должно быть, разделяют свою ДНК, используя механизм бессмертной цепи ДНК. Джошуа Мерок и др. из лаборатории Джеймса Шерли сконструировали клетки млекопитающих с индуцируемым геном p53 , который контролирует асимметричные деления. Эксперименты с импульсом/погоней BrdU с этими клетками показали, что хромосомы расходятся неслучайно только тогда, когда клетки были вынуждены делиться асимметрично, как взрослые стволовые клетки. Эти асимметрично делящиеся клетки представляют собой модель in vitro для демонстрации и исследования механизмов бессмертной цепи.

Ученые стремились продемонстрировать, что этот механизм бессмертной цепи ДНК существует in vivo в других типах взрослых стволовых клеток. В 1996 году Ник Зепс опубликовал первую статью, демонстрирующую наличие клеток, удерживающих метки, в молочной железе мыши. и это было подтверждено в 2005 году Гилбертом Смитом, который также опубликовал доказательства того, что подмножество эпителиальных клеток молочной железы мышей может сохранять метку ДНК и высвобождать метку ДНК способом, соответствующим механизму бессмертной цепи ДНК. Вскоре после этого ученые из лаборатории Дерека ван дер Коя показали, что у мышей есть нервные стволовые клетки, которые сохраняют BrdU и продолжают оставаться митотически активными. Асимметричное разделение ДНК было показано с помощью визуализации клеток в культуре в реальном времени. В 2006 году ученые из лаборатории Шахрагима Таджбахша представили доказательства того, что мышечные сателлитные клетки , которые предположительно являются взрослыми стволовыми клетками скелетных мышц , при помещении в культуру демонстрируют асимметричную сегрегацию ДНК, меченной BrdU. У них также были доказательства того, что кинетика высвобождения BrdU, соответствующая механизму бессмертной цепи ДНК, действовала in vivo с использованием молодых мышей и мышей с регенерацией мышц, индуцированной замораживанием.

Однако эти эксперименты, подтверждающие гипотезу бессмертной нити, не являются окончательными. Хотя эксперименты Ларка продемонстрировали совместную сегрегацию, она могла быть артефактом излучения трития. Хотя Поттен идентифицировал циклические клетки, сохраняющие метку, как взрослые стволовые клетки, эти клетки трудно однозначно идентифицировать как взрослые стволовые клетки. Хотя сконструированные клетки представляют собой элегантную модель совместной сегрегации хромосом, исследования этих клеток проводились in vitro с использованием сконструированных клеток. Некоторые особенности могут отсутствовать in vivo или отсутствовать in vitro . В мае 2007 года Майкл Конбой и др. обнаружили доказательства в поддержку теории бессмертной нити ДНК. использование модели мышечных стволовых/сателлитных клеток во время регенерации тканей, когда происходит огромное деление клеток в течение относительно короткого периода времени. Используя два аналога BrdU для маркировки матрицы и вновь синтезированных цепей ДНК, они увидели, что около половины делящихся клеток в регенерирующих мышцах сортируют более старую «Бессмертную» ДНК в одну дочернюю клетку, а более молодую ДНК в другую. В соответствии с гипотезой стволовых клеток, более недифференцированная дочь обычно наследовала хроматиды со старшей ДНК, тогда как более дифференцированная дочь наследовала более молодую ДНК.

Экспериментальные доказательства против гипотезы бессмертной нити скудны. В одном исследовании исследователи включили тритированный тимидин в делящиеся базальные клетки эпидермиса мышей. Они следили за высвобождением тритированного тимидина после различных периодов преследования, но характер высвобождения не соответствовал гипотезе бессмертной цепи. Хотя они обнаружили клетки, сохраняющие метку, они не находились в предполагаемом компартменте стволовых клеток. С увеличением продолжительности периодов преследования эти клетки, удерживающие метку, располагались дальше от предполагаемого компартмента стволовых клеток, что позволяет предположить, что клетки, удерживающие метку, переместились. Однако найти убедительные доказательства против гипотезы бессмертной нити оказалось сложно.

Сегрегация цепи ДНК-матрицы была изучена у развивающихся рыбок данио . Во время личиночного развития происходило быстрое истощение старых нитей матрицы ДНК из стволовых клеток ниш в сетчатке , мозге и кишечнике. С помощью микроскопии высокого разрешения не было обнаружено никаких доказательств асимметричной сегрегации матричной цепи (в более чем 100 парах клеток), что делает маловероятным, что при развитии рыбок данио асимметричная сегрегация ДНК позволяет избежать мутационного бремени, как предполагает гипотеза бессмертной цепи.

Другие модели

После того, как Кэрнс впервые предложил механизм бессмертной цепи ДНК, теория претерпела несколько обновлений.

В 2002 году он предположил, что в дополнение к использованию механизмов бессмертной цепи ДНК для разделения ДНК, когда бессмертные цепи ДНК взрослых стволовых клеток подвергаются повреждению, они предпочтут умереть (апоптоз), а не использовать механизмы репарации ДНК, которые обычно используются в не -стволовые клетки.

Эммануэль Дэвид Танненбаум и Джеймс Шерли разработали количественную модель, описывающую, как репарация точковых мутаций может отличаться во взрослых стволовых клетках. Они обнаружили, что во взрослых стволовых клетках восстановление было наиболее эффективным, если для разделения ДНК использовался механизм бессмертной цепи ДНК, а не механизм случайного разделения. Этот метод был бы полезен, поскольку он позволяет избежать неправильной фиксации мутаций ДНК в обеих цепях ДНК и распространения мутации.

Механизмы

Полное доказательство концепции обычно требует правдоподобного механизма, который мог бы опосредовать результат. Хотя это и спорно, есть предположение, что это может обеспечить Dynein Motor. Этот документ сопровождается комментарием, в котором суммируются выводы и предыстория.

Однако среди критиков эта работа пользуется большим уважением среди биологов, о чем свидетельствует дополнительный комментарий к статье тех же авторов от 2006 года. Авторы опровергли критику.

См. также

• Теломера