Ионно-полупроводниковое секвенирование
Ионно-полупроводниковое секвенирование — метод секвенирования ДНК, на обнаружении ионов водорода , которые выделяются при полимеризации ДНК основанный . Это метод «секвенирования путем синтеза», при котором комплементарная цепь строится на основе последовательности матричной цепи .
Микролунка, содержащая матричную цепь ДНК, подлежащую секвенированию, заполняется одним видом дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP). Если введенный dNTP комплементарен ведущему матричному нуклеотиду, он включается в растущую комплементарную цепь. Это вызывает высвобождение ионов водорода, который запускает ионный датчик ISFET , что указывает на то, что произошла реакция. Если в матричной последовательности присутствуют гомополимерные повторы, несколько молекул dNTP будут включены в один цикл. Это приводит к соответствующему количеству высвободившихся атомов водорода и пропорционально более высокому электронному сигналу.
Эта технология отличается от других технологий секвенирования путем синтеза тем, что не модифицированные нуклеотиды или оптика используются . Ионно-полупроводниковое секвенирование также можно назвать секвенированием ионного потока, pH-опосредованным секвенированием, кремниевым секвенированием или полупроводниковым секвенированием.
История развития технологий
[ редактировать ]Технология была лицензирована компанией DNA Electronics Ltd. [1] [2] разработан Ion Torrent Systems Inc. и выпущен в феврале 2010 года. [3] Ion Torrent позиционирует свою машину как быстрый, компактный и экономичный секвенатор, который можно использовать в большом количестве лабораторий в качестве настольного аппарата. [4] компании Roche Подразделение 454 Life Sciences сотрудничает с DNA Electronics в разработке платформы для полупроводникового секвенирования с высокой плотностью считывания и высокой плотности с использованием этой технологии. [5]
Технология
[ редактировать ]
Секвенирование химии
[ редактировать ]В природе включение дезоксирибонуклеозидтрифосфата ( dNTP) в растущую цепь ДНК включает образование ковалентной связи и высвобождение пирофосфата и положительно заряженного иона водорода . [1] [3] [6] dNTP будет включен только в том случае, если он комплементарен ведущему неспаренному нуклеотиду матрицы. Ионно-полупроводниковое секвенирование использует эти факты, определяя, высвобождается ли ион водорода при внесении в реакцию одного вида dNTP.
Микролунки на полупроводниковом чипе , каждая из которых содержит множество копий одной одноцепочечной молекулы матричной ДНК, подлежащей секвенированию, и ДНК-полимеразу, последовательно заполняются немодифицированным A, C, G или T dNTP. [3] [7] [8] Если введенный dNTP комплементарен следующему неспаренному нуклеотиду на цепи матрицы, он включается в растущую комплементарную цепь ДНК-полимеразой. [9] Если введенный dNTP не является комплементарным, не происходит ни включение, ни биохимическая реакция. Ион водорода, выделяющийся в ходе реакции, изменяет pH раствора, который обнаруживается ISFET . [1] [3] [7] Неприсоединившиеся молекулы dNTP вымываются перед следующим циклом, когда вводится другой вид dNTP. [7]
Обнаружение сигнала
[ редактировать ]Под слоем микролунок находится ионочувствительный слой, под которым находится датчик ионов ISFET . [4] Все слои содержатся в полупроводниковом кристалле КМОП , аналогичном тому, который используется в электронной промышленности. [4] [10]
Каждый чип содержит массив микролунок с соответствующими детекторами ISFET . [7] Каждый выпущенный ион водорода запускает ионный датчик ISFET . Серия электрических импульсов, передаваемых от чипа к компьютеру, преобразуется в последовательность ДНК без необходимости промежуточного преобразования сигнала. [7] [11] Поскольку события включения нуклеотидов измеряются непосредственно с помощью электроники, можно избежать использования меченых нуклеотидов и оптических измерений. [4] [10] Обработку сигналов и сборку ДНК можно затем выполнить с помощью программного обеспечения.
Характеристики секвенирования
[ редактировать ]Точность на базу, достигнутая компанией Ion Torrent на полупроводниковом секвенаторе Ion Torrent Ion по состоянию на февраль 2011 года, составила 99,6% на основе чтения 50 баз со скоростью 100 МБ за цикл. [12] Длина чтения по состоянию на февраль 2011 года составляла 100 пар оснований . [12] Точность для гомополимерных повторов длиной 5 повторов составила 98%. [12] Более поздние версии показывают длину чтения 400 пар оснований. [13] Эти цифры еще не были проверены независимо за пределами компании.
Сильные стороны
[ редактировать ]Основными преимуществами ионно-полупроводникового секвенирования являются высокая скорость секвенирования и низкие первоначальные и эксплуатационные затраты. [8] [11] Это стало возможным благодаря отказу от модифицированных нуклеотидов и оптических измерений.
Поскольку система записывает события включения нуклеотидов, опосредованные естественной полимеразой, секвенирование может происходить в режиме реального времени. В действительности скорость секвенирования ограничена круговоротом нуклеотидов- субстратов через систему. [14] Ion Torrent Systems Inc., разработчик технологии, утверждает, что каждое измерение включения занимает 4 секунды, а каждый прогон — около часа, в течение которого секвенируются 100-200 нуклеотидов. [11] [15] Если полупроводниковые чипы улучшаются (как предсказывает закон Мура ), количество операций чтения на чип (и, следовательно, за цикл) должно увеличиться. [11]
Стоимость приобретения pH-опосредованного секвенатора от Ion Torrent Systems Inc. на момент запуска составляла около 50 000 долларов США, не считая оборудования для подготовки проб и сервера для анализа данных. [8] [11] [15] Стоимость одного цикла также значительно ниже, чем у альтернативных методов автоматического секвенирования, и составляет примерно 1000 долларов. [8] [12]
Ограничения
[ редактировать ]Если гомополимер повторяет один и тот же нуклеотид (например, ТТТТТ ) присутствуют на цепи матрицы (цепи, подлежащей секвенированию), тогда включается несколько введенных нуклеотидов и за один цикл высвобождается больше ионов водорода. Это приводит к большему изменению pH и пропорционально большему электронному сигналу. [11] Это ограничение системы состоит в том, что сложно подсчитать длинные повторы. Это ограничение характерно и для других методов обнаружения добавлений отдельных нуклеотидов, таких как пиросеквенирование . [16] Сигналы, генерируемые большим количеством повторов, трудно отличить от повторов с таким же, но другим количеством повторов; например , гомоповторы длины 7 трудно отличить от гомоповторов длины 8.
Еще одним ограничением этой системы является короткая длина считывания по сравнению с другими методами секвенирования, такими как секвенирование по Сэнгеру или пиросеквенирование . Более длинные длины чтения полезны для de novo сборки генома . Полупроводниковые секвенаторы Ion Torrent производят среднюю длину чтения примерно 400 нуклеотидов за одно чтение. [3] [8]
Пропускная способность на данный момент ниже, чем у других высокопроизводительных технологий секвенирования, хотя разработчики надеются изменить это за счет увеличения плотности чипа . [3]
Приложение
[ редактировать ]Разработчики полупроводникового секвенатора Ion Torrent позиционируют его как быстрый, компактный и экономичный секвенатор, который можно использовать в большом количестве лабораторий в качестве настольного аппарата. [3] [4] Компания надеется, что их система позволит проводить секвенирование за пределами специализированных центров и сделать его доступным для больниц и небольших лабораторий. [17] Статья New York Times в январе 2011 года «Привнесение секвенирования ДНК в массы» подчеркивает эти амбиции. [17]
Благодаря способности альтернативных методов секвенирования достигать большей длины считывания (и, следовательно, более подходящей для анализа всего генома ), эта технология может лучше всего подходить для небольших масштабов, таких как секвенирование микробного генома, секвенирование микробного транскриптома , целевое секвенирование, ампликонов секвенирование . или для проверки качества библиотек секвенирования. [3] [8] [18]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с Bio-IT World, Дэвис, К. Powering Preventive Medicine. Архивировано 6 июня 2016 г. в Wayback Machine . Мир БиоИТ 2011
- ^ GenomeWeb DNA Electronics лицензирует IP для Ion Torrent . август 2010 г.
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час Раск, Н. (2011). «Потоки последовательности» . Нат Мет 8(1): 44-44.
- ^ Jump up to: а б с д и Официальная веб-страница Ion Torrent. Архивировано 6 ноября 2012 г. на Wayback Machine .
- ^ GenomeWeb Roche сотрудничает с DNA Electronics, чтобы помочь перевести платформу 454 на электрохимическое обнаружение . ноябрь 2010 г.
- ^ Пурушотаман, С., Тумазу, К., Оу, CP. Обнаружение протонов и однонуклеотидного полиморфизма: простое использование ионно-чувствительного полевого транзистора.
- ^ Jump up to: а б с д и Пенниси, Э. (2010). «Полупроводники вдохновляют новые технологии секвенирования». Наука . 327 (5970): 1190. Бибкод : 2010Sci...327.1190P . дои : 10.1126/science.327.5970.1190 . ПМИД 20203024 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж Перкель, Дж., «Вступая в контакт с четвертым поколением секвенирования». Архивировано 27 декабря 2013 г. в Wayback Machine . Биотехника, 2011.
- ^ Альбертс Б., Молекулярная биология клетки . 5-е издание изд. 2008, Нью-Йорк: Garland Science.
- ^ Jump up to: а б Кароу, Дж. (2009) Патентное приложение Ion Torrent предлагает технологию секвенирования с использованием химически чувствительных полевых транзисторов . В последовательности.
- ^ Jump up to: а б с д и ж Мир Bio-IT, Дэвис, К. Это «Ватсон встречает Мура», когда Ion Torrent представляет полупроводниковое секвенирование. Архивировано 2 августа 2015 г. в Wayback Machine . Мир БиоИТ 2010.
- ^ Jump up to: а б с д Кароу, Дж. (2009) В AGBT клиенты Ion Torrent предоставляют первую обратную связь; Life Tech описывает рост платформы . В последовательности.
- ^ https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/Small-Genome-Ecoli-De-Novo-App-Note.pdf . Архивировано 30 августа 2014 г. в Wayback Machine. [ только URL-адрес PDF ]
- ^ Эйд, Дж. и др., «Секвенирование ДНК в реальном времени из отдельных молекул полимеразы» . Наука, 2009. 323(5910): с. 133-8.
- ^ Jump up to: а б Кароу, Дж. (2010) Ion Torrent Systems представляет электронный секвенсор стоимостью 50 000 долларов на выставке AGBT . В последовательности.
- ^ Мецкер, М.Л., «Новые технологии секвенирования ДНК» . Genome Res, 2005. 15(12): с. 1767-76.
- ^ Jump up to: а б Поллак А., «Привнесение секвенирования ДНК в массы» , в New York Times. 2011: Нью-Йорк.
- ^ Чиозеа, СИ; Уильямс, Л; Гриффит, CC; Томпсон, Л.Д.; Вайнреб, я; Бауман, Дж. Э.; Лувисон, А; Рой, С; Ситхала, РР; Никифорова, Миннесота (июнь 2015 г.). «Молекулярная характеристика апокринного рака слюнных протоков». Американский журнал хирургической патологии . 39 (6): 744–52. doi : 10.1097/pas.0000000000000410 . ПМИД 25723113 . S2CID 34106002 .