Полимеразная цепная реакция с переключением матрицы
Полимеразная цепная реакция с переключением матрицы ( TS-PCR ) — это метод обратной транскрипции и амплификации полимеразной цепной реакции (PCR), который основан на природной последовательности праймера PCR в сайте полиаденилирования , также известном как поли(A)-хвост, и добавляет второй праймер через активность вируса мышиного лейкоза обратной транскриптазы . [ 1 ] Это позволяет считывать полные последовательности кДНК и может обеспечить высокий выход из отдельных источников, даже из отдельных клеток, которые содержат от 10 до 30 , с пикограммов мРНК относительно низкими уровнями (3-5%) загрязняющей последовательности рРНК . Этот метод часто используется при секвенировании всего транскриптома . Он продается компанией Clontech как механизм переключения на 5'-конце матрицы РНК ( SMART ). [ 2 ] [ 3 ] а также с помощью Diagenode как захвата и усиления путем отслеживания и переключения ( CATS ).
Drop-Seq
[ редактировать ]Используя шприцевые насосы для передачи постоянной скорости изолированных клеток и шариков с уникальным олигонуклеотидным штрих-кодом, можно изолировать отдельные клетки и шарики вместе в каплях лизирующего буфера, где сайт полиаденилирования связывается с праймером, содержащим уникальную идентифицирующую последовательность. [ 4 ] Этот праймер также содержит общую последовательность перед идентификатором, так что после ее расширения посредством обратной транскрипции последующие раунды ПЦР будут включать метку, что позволяет отслеживать каждую выделенную секвенированную кДНК до конкретной исходной гранулы. Это позволяет одновременно анализировать относительные уровни транскриптов во многих отдельных клетках, создавая рациональную основу для классификации этих клеток на определенные типы клеток . [ 5 ] или разрешить логический вывод данных гибридизации in situ эмбрионов без фактического проведения эксперимента. [ 6 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Л. Петалидис; С. Бхаттачарья; Г. А. Моррис; В. П. Коллинз; ТК Фриман; Пенсильвания Лайонс (15 ноября 2003 г.). «Глобальная амплификация мРНК с помощью ПЦР с переключением матрицы: линейность и применение к микрочиповому анализу» . Исследования нуклеиновых кислот . 31 (22): е142. дои : 10.1093/нар/gng142 . ПМЦ 275579 . ПМИД 14602935 .
- ^ «Транскриптомный анализ отдельных клеток с помощью технологии SMARTer» . Клонтех.
- ^ Чжу Ю.Ю., Махледер Э.М., Ченчик А., Ли Р., Зиберт П.Д. (апрель 2001 г.). «Переключение шаблона обратной транскриптазы: подход SMART для создания полноразмерной библиотеки кДНК» . БиоТехники . 30 (4): 892–7. дои : 10.2144/01304pf02 . ПМИД 11314272 .
- ^ Стив МакКэрролл. «Лаборатория МакКэрролла» . Гарвард. (включает обновленный протокол, ссылку на публикацию, программное обеспечение и наборы данных)
- ^ Эмили Андервуд (07 августа 2015 г.). «Кризис идентичности мозга» . Наука . 349 (6248): 575–577. дои : 10.1126/science.349.6248.575 . ПМИД 26250665 .
- ^ Рахул Сатиджа; Джеффри Фаррелл; Дэвид Геннерт; Александр Ф Шир; Авив Регев1 (2015). «Пространственная реконструкция данных экспрессии генов в одной клетке» . Природная биотехнология . 33 (5): 495–502. дои : 10.1038/nbt.3192 . ПМЦ 4430369 . ПМИД 25867923 .
{{cite journal}}: CS1 maint: числовые имена: список авторов ( ссылка )
 | Эта по молекулярной биологии статья незавершена . Вы можете помочь Википедии, расширив ее . |