in situ Гибридизация

Гибридизация in situ (ISH) — это тип гибридизации , при котором используется меченая комплементарная ДНК , РНК или модифицированная цепь нуклеиновой кислоты (т. е. зонд ) для локализации определенной последовательности ДНК или РНК в части или участке ткани ( in situ ) или если ткань достаточно мала (например, семена растений, эмбрионы дрозофилы ), во всей ткани (целый препарат ISH), в клетках и в циркулирующих опухолевых клетках (ЦОК). Это отличается от иммуногистохимии , которая обычно локализует белки в срезах ткани.

Гибридизация in situ используется для выявления местоположения определенных последовательностей нуклеиновых кислот на хромосомах или в тканях, что является важным шагом для понимания организации, регуляции и функции генов. Ключевые методы, используемые в настоящее время, включают гибридизацию in situ с мРНК с олигонуклеотидными целиком и РНК-зондами (как радиоактивно-меченными, так и гаптен-меченными), анализ с помощью светового и электронного микроскопов, гибридизацию in situ , двойное обнаружение РНК и РНК плюс белок, и флуоресцентная гибридизация in situ для обнаружения хромосомных последовательностей. ДНК ISH можно использовать для определения структуры хромосом. Флуоресцентная ДНК ISH (FISH) может, например, использоваться в медицинской диагностике для оценки целостности хромосом. РНК ISH (гибридизация РНК in situ ) используется для измерения и локализации РНК (мРНК, днРНК и микроРНК) в срезах тканей, клетках, целых препаратах и циркулирующих опухолевых клетках (ЦОК). Гибридизацию in situ изобрели американские биологи Мэри-Лу Пардью и Джозеф Г. Галл. . ^[1]^[2]^[3]

Проблемы гибридизации in-situ

Гибридизация in situ — мощный метод идентификации конкретных видов мРНК внутри отдельных клеток в срезах тканей, позволяющий лучше понять физиологические процессы и патогенез заболеваний. Однако гибридизация in situ требует выполнения множества шагов с точной оптимизацией для каждой исследуемой ткани и каждого используемого зонда. Чтобы сохранить целевую мРНК в тканях, часто требуется сшивающие фиксаторы (например, формальдегид ). использовать ^[4]

Кроме того, гибридизация in-situ на срезах ткани требует, чтобы срезы ткани были очень тонкими, обычно толщиной от 3 до 7 мкм. Обычные методы подготовки срезов тканей для обработки гибридизации in-situ включают разрезание образцов с помощью криостата или слайсера ткани Compresstome . Криостат . берет свежую или фиксированную ткань и погружает ее в жидкий азот для мгновенного замораживания Затем ткань помещают в замораживающую среду, называемую ОКТ, и делают тонкие срезы. К препятствиям относятся появление на тканях артефактов замораживания, которые могут помешать правильному окрашиванию мРНК. Compresstome разрезает ткань на тонкие ломтики без процесса замораживания; Свободно плавающие срезы вырезают после помещения в агарозу для стабильности. Этот метод позволяет избежать замораживания тканей и, следовательно, связанных с ним артефактов замораживания. После завершения процесс является постоянным и необратимым. ^[5]

Процесс

Для гибридизационной гистохимии образцы клеток и тканей обычно обрабатывают, чтобы зафиксировать целевые транскрипты на месте и улучшить доступ зонда. Как отмечалось выше, зонд представляет собой либо меченую комплементарную ДНК , либо, что сейчас чаще всего, комплементарную РНК ( рибозонд ). Зонд гибридизуется с целевой последовательностью при повышенной температуре, а затем избыток зонда смывается (после предварительного гидролиза с использованием РНКазы в случае негибридизированного зонда с избытком РНК). Параметры раствора, такие как температура, соль и/или концентрация детергента, можно манипулировать для устранения любых неидентичных взаимодействий (т. е. только точные совпадения последовательностей останутся связанными). Затем зонд, который был помечен радио-, флуоресцентно- или антиген-мечеными основаниями (например, дигоксигенином ), локализуется и количественно определяется в ткани с помощью авторадиографии , флуоресцентной микроскопии или иммуногистохимии соответственно. ISH также может использовать два или более зондов, помеченных радиоактивностью или другими нерадиоактивными метками, для одновременного обнаружения двух или более транскриптов.

Альтернативная технология, анализ разветвленной ДНК , может быть использована для анализа РНК (мРНК, днРНК и микроРНК) in situ в анализах гибридизации с чувствительностью к одной молекуле без использования радиоактивности. Этот подход (например, анализы ViewRNA) можно использовать для визуализации до четырех мишеней в одном анализе, и он использует запатентованную конструкцию зонда и амплификацию сигнала бДНК для генерации чувствительных и специфичных сигналов. Образцы (клетки, ткани и ЦОК) фиксируются, затем обрабатываются, чтобы обеспечить доступность мишени РНК (демаскировка РНК). Целенаправленные зонды гибридизуются с каждой целевой РНК. Последующая амплификация сигнала основана на специфической гибридизации соседних зондов (отдельных олигонуклеотидов [олигонуклеотидов], которые бок о бок связываются с мишенями РНК). Типичный зонд, специфичный для мишени, будет содержать 40 олигонуклеотидов, в результате чего образуется 20 пар олигонуклеотидов, которые бок о бок связываются с мишенью для обнаружения мРНК и днРНК, а также 2 олигонуклеотида или одна пара для обнаружения микроРНК. Усиление сигнала достигается посредством серии последовательных этапов гибридизации. Молекула предварительного усилителя гибридизуется с каждой парой олигонуклеотидов на целевой РНК, затем несколько молекул усилителя гибридизуются с каждым предусилителем. Затем олигонуклеотиды с несколькими метками-зондами (конъюгированные с щелочной фосфатазой или непосредственно с флуорофорами) гибридизуются с каждой молекулой усилителя. Полностью собранная структура усиления сигнала «Дерево» имеет 400 сайтов связывания для зондов-меток. Когда все мишене-специфичные зонды связываются с целевым транскриптом мРНК, для этого одного транскрипта происходит 8000-кратная амплификация сигнала. Отдельные, но совместимые системы усиления сигнала позволяют проводить мультиплексные анализы. Сигнал можно визуализировать с помощью флуоресцентного или светлопольного микроскопа.

Основные этапы работы с зондами, меченными дигоксигенином

пермеабилизация клеток протеиназой К для открытых клеточных мембран (около 25 минут, не требуется для срезов тканей или некоторых эмбрионов на ранних стадиях)
связывание мРНК с меченым зондом РНК (обычно в течение ночи)
Связывание антитело-фосфатазы с РНК-зондом (несколько часов)
окрашивание антител (например, щелочной фосфатазой )

Протокол занимает около 2–3 дней и требует некоторого времени для настройки. Некоторые компании продают роботов для автоматизации процесса (например, CEM InsituPro). В результате в лабораториях были проведены масштабные проверки тысяч генов. Доступ к результатам обычно можно получить через веб-сайты (см. внешние ссылки). ^[6]

См. также

Ссылки

^ О'Коннор, Клэр. «Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)» . Природное образование.
^ Галл, Дж. Г .; Пардью, ML (июнь 1969 г.). «Формирование и обнаружение гибридных молекул РНК-ДНК в цитологических препаратах» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 63 (2): 378–83. Бибкод : 1969ПНАС...63..378Г . дои : 10.1073/pnas.63.2.378 . ПМК 223575 . ПМИД 4895535 .
^ Галл, Джо . «Премия Альберта Ласкера за особые достижения в медицинской науке» . Фонд Ласкера.
^ Леманн, Рут; Таутц, Дитхард (1 января 1994 г.), Гольдштейн, Лоуренс С.Б.; Фирберг, Эрик А. (ред.), Глава 30. Гибридизация in situ с РНК , Методы клеточной биологии, том. 44, Academic Press, стр. 575–598, номер документа : 10.1016/s0091-679x(08)60933-4 , ISBN. 9780125641456 , PMID 7535885 , получено 21 февраля 2021 г.
^ Браун, Линдси А.; Хантсман, Дэвид (1 мая 2007 г.). «Флуоресцентная гибридизация in situ на тканевых микрочипах: проблемы и решения» . Журнал молекулярной гистологии . 38 (2): 151–157. дои : 10.1007/s10735-006-9069-y . ISSN 1567-2387 . ПМИД 17216303 . S2CID 6363208 .
^ Паноскальцис-Мортари, А.; Бьюси, Р.П. (февраль 1995 г.). «Гибридизация in situ с меченными дигоксигенином РНК-зондами: факты и артефакты» . БиоТехники . 18 (2): 300–307. ISSN 0736-6205 . ПМИД 7727134 .

Джин, Л; Ллойд, Р.В. (1997). «Гибридизация in situ: методы и приложения» . Журнал клинического лабораторного анализа . 11 (1): 2–9. doi : 10.1002/(SICI)1098-2825(1997)11:1<2::AID-JCLA2>3.0.CO;2-F . ПМК 6760707 . ПМИД 9021518 .
Комплексная и аннотированная гистохимия гибридизации in situ.
Секвенирование РНК циркулирующих в поджелудочной железе опухолевых клеток предполагает передачу сигналов WNT в метастазировании
Локальный транскриптом в синаптическом нейропиле, выявленный с помощью глубокого секвенирования и визуализации высокого разрешения

Внешние ссылки

In+Situ+Гибридизация в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
Гибридизация in situ зондов РНК и микроРНК с клетками, ЦОК и тканями.
Цельная гибридизация in situ зондов РНК с растительными тканями
Подготовка комплексных наборов ДНК-зондов для 3D FISH с использованием до шести различных флуорохромов
Транскрипт in situ гибридизации цельных эмбрионов для анализа фенотипа дрозофилы, обработанной РНКи
базы данных на местах:

[1] О'Коннор, Клэр. «Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)» . Природное образование.

[2] Галл, Дж. Г .; Пардью, ML (июнь 1969 г.). «Формирование и обнаружение гибридных молекул РНК-ДНК в цитологических препаратах» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 63 (2): 378–83. Бибкод : 1969ПНАС...63..378Г . дои : 10.1073/pnas.63.2.378 . ПМК 223575 . ПМИД 4895535 .

[3] Галл, Джо . «Премия Альберта Ласкера за особые достижения в медицинской науке» . Фонд Ласкера.

[4] Леманн, Рут; Таутц, Дитхард (1 января 1994 г.), Гольдштейн, Лоуренс С.Б.; Фирберг, Эрик А. (ред.), Глава 30. Гибридизация in situ с РНК , Методы клеточной биологии, том. 44, Academic Press, стр. 575–598, номер документа : 10.1016/s0091-679x(08)60933-4 , ISBN. 9780125641456 , PMID 7535885 , получено 21 февраля 2021 г.

[5] Браун, Линдси А.; Хантсман, Дэвид (1 мая 2007 г.). «Флуоресцентная гибридизация in situ на тканевых микрочипах: проблемы и решения» . Журнал молекулярной гистологии . 38 (2): 151–157. дои : 10.1007/s10735-006-9069-y . ISSN 1567-2387 . ПМИД 17216303 . S2CID 6363208 .

[6] Паноскальцис-Мортари, А.; Бьюси, Р.П. (февраль 1995 г.). «Гибридизация in situ с меченными дигоксигенином РНК-зондами: факты и артефакты» . БиоТехники . 18 (2): 300–307. ISSN 0736-6205 . ПМИД 7727134 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]