Анализ разветвленной ДНК
 | Эта статья нуждается в дополнительных цитатах для проверки . ( ноябрь 2017 г. ) |
В биологии анализ разветвленной ДНК представляет собой анализ амплификации сигнала (в отличие от анализа целевой амплификации), который используется для обнаружения молекул нуклеиновой кислоты . [ 1 ]
Метод
[ редактировать ]Анализ разветвленной ДНК начинается с чашки или другого твердого носителя (например, пластикового щупа). Блюдо усеяно маленькими одноцепочечными молекулами (или цепочками) ДНК, которые торчат в раствор. Они известны как молекулы ДНК-зонда захвата. Далее добавляется молекула ДНК-удлинителя. Каждый расширитель имеет два домена; тот, который гибридизуется с молекулой захватывающей ДНК, и тот, который выступает над поверхностью. Цель расширителя двоякая. Во-первых, это создает больше доступной площади поверхности для связывания целевых молекул ДНК, а во-вторых, позволяет легко адаптировать анализ для обнаружения различных целевых молекул ДНК.
Как только молекулы захвата и наполнителя окажутся на месте и гибридизируются, можно добавить образец. Молекулы-мишени в образце будут связываться с молекулой наполнителя. В результате получается основание, наполненное зондами захвата, которые гибридизуются с зондами-удлинителями, которые, в свою очередь, гибридизуются с молекулами-мишенями.
В этот момент происходит усиление сигнала. Добавляется молекула ДНК-удлинителя метки, имеющая два домена (аналогично первому удлинителю). Удлинитель метки гибридизуется с мишенью и предварительно амплифицированной молекулой. Молекула предусилителя имеет два домена. Во-первых, он связывается с расширителем метки, а во-вторых, с молекулой усилителя. Примером молекулы-усилителя является олигонуклеотидная цепь, связанная с ферментом щелочной фосфатазой .
Схематически этот процесс можно представить так:
База → Зонд захвата → Удлинитель → Мишень → Удлинитель метки → предусилитель → усилитель
Использование и преимущества
[ редактировать ]Этот анализ можно использовать для обнаружения и количественной оценки многих типов РНК или ДНК-мишеней. В ходе анализа разветвленную ДНК смешивают с тестируемым образцом. Обнаружение осуществляется с использованием нерадиоактивного метода и не требует предварительной амплификации обнаруживаемой нуклеиновой кислоты. Анализ полностью основан на гибридизации. Ферменты используются для определения степени гибридизации, но не для манипулирования нуклеиновыми кислотами. Таким образом, небольшие количества нуклеиновой кислоты можно обнаружить и количественно оценить без стадии обратной транскрипции (в случае РНК) и/или ПЦР . Анализ можно проводить как высокопроизводительный анализ, в отличие от количественного нозерн-блоттинга или анализа защиты РНКазы, которые трудоемки и, следовательно, их трудно выполнять на большом количестве образцов. Другим основным высокопроизводительным методом, используемым для количественного определения конкретных молекул РНК, является количественная ПЦР после обратной транскрипции РНК в кДНК .
несколько различных коротких одноцепочечных молекул ДНК ( олигонуклеотидов В анализе разветвленной ДНК используются ). Олигонуклеотиды захвата и захвата-удлинителя связываются с нуклеиновой кислотой-мишенью и иммобилизуют ее на твердой подложке. Затем меточный олигонуклеотид и разветвленная ДНК обнаруживают иммобилизованную целевую нуклеиновую кислоту. Иммобилизация мишени на твердой опоре облегчает обширную промывку, что снижает ложноположительные результаты. После связывания мишени с твердой подложкой ее можно обнаружить с помощью разветвленной ДНК, связанной с ферментом (например, щелочной фосфатазой). Разветвленная ДНК связывается с нуклеиновой кислотой образца путем специфической гибридизации в областях, не занятых гибридами захвата. Разветвление ДНК позволяет очень плотно декорировать ДНК ферментом, что важно для высокой чувствительности анализа. [ нужна ссылка ] . Фермент катализирует реакцию субстрата, который генерирует свет (обнаруживаемый в люминометре). Количество излучаемого света увеличивается с увеличением количества конкретной нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце. Конструкция разветвленной ДНК и способ ее гибридизации с исследуемой нуклеиновой кислотой различаются в зависимости от поколения анализа бДНК. [ 2 ] Несмотря на то, что исходный материал не подвергается предварительной амплификации, анализы бДНК позволяют обнаружить менее 100 копий РНК ВИЧ на мл крови. [ 2 ] В недавней публикации в журнале Nature Scientific Reports уровни вкДНК используются в качестве показателя эффективности химиотерапии при лечении рака на поздних стадиях, а также используется подход с разветвленной ДНК для усиления сигнала следов вкДНК. [ 3 ]
См. также
[ редактировать ]Примечания и ссылки
[ редактировать ]- ^ Ариффин, Сити Нур Фатилах Ахмад (2013). «Разветвленная ДНК: новый метод молекулярной диагностики в исследованиях костей» . Обновления исследований в области медицинских наук (RUMeS) . 1 (1): 27–29.
- ^ Jump up to: а б Коллинз, МЛ; Ирвин, Б.; Тайнер, Д.; Хорошо, Э.; Заяти, К.; Чанг, К.; Хорн, Т.; Але, Д.; Детмер, Дж.; Шен, LP; Кольберг, Дж.; Бушнелл, С.; Урдеа, М.С.; Хо, Д.Д. (1997). «Анализ амплификации сигнала разветвленной ДНК для количественного определения целевых нуклеиновых кислот ниже 100 молекул/мл» . Исследования нуклеиновых кислот . 25 (15): 2979–2984. дои : 10.1093/нар/25.15.2979 . ПМК 146852 . ПМИД 9224596 .
- ^ Чжоу, Сяорун; Ли, Ченчен; Чжан, Чжао; Ли, Дэниел Ю.; Ду, Цзиньвэй; Дин, Пинг; Мэн, Хайян; Сюй, Хуэй; Ли, Ронглей; Эй, Эффи; Чжан, Айго (07 апреля 2021 г.). «Кинетика вкДНК плазмы предсказывает клинический ответ у пациентов с немелкоклеточным раком легких» . Научные отчеты . 11 (1): 7633. Бибкод : 2021NatSR..11.7633Z . дои : 10.1038/s41598-021-85797-z . ISSN 2045-2322 . ПМК 8027214 . ПМИД 33828112 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Разветвленный+ДНК+Анализ в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)