Анализ гибридизации
Анализ гибридизации включает любую форму поддающейся количественной оценке гибридизации , т.е. количественный отжиг двух комплементарных цепей нуклеиновых кислот , известный как гибридизация нуклеиновых кислот . [ 1 ]
Обзор
[ редактировать ]В контексте биохимии и разработки лекарств анализ гибридизации представляет собой тип анализа связывания лиганда (LBA), используемый для количественного определения нуклеиновых кислот в биологических матрицах. Анализы гибридизации могут проводиться в растворе или на твердой подложке, такой как 96-луночные планшеты или меченые шарики.
Анализы гибридизации включают меченые зонды нуклеиновой кислоты для идентификации родственных молекул ДНК или РНК (т.е. со значительно высокой степенью сходства последовательностей) внутри сложной смеси немеченых молекул нуклеиновой кислоты . Антисмысловая терапия , миРНК и другие на основе олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот биотерапевтические средства могут быть количественно оценены с помощью анализов гибридизации.
Передача сигналов методами гибридизации может осуществляться с использованием олигонуклеотидных зондов, модифицированных в процессе синтеза гаптенами и низкомолекулярными лигандами , которые действуют гомологично антителам для захвата и обнаружения. Как и в традиционном ИФА конъюгаты пероксидазы хрена (HRP) или щелочной фосфатазы , в качестве вторичных антител можно использовать (AP).
Анализ сэндвич-гибридизации
[ редактировать ]
В формате анализа ELISA сэндвич-гибридизации антиген-лиганд и антитела в ELISA заменяются аналитом нуклеиновой кислоты, комплементарными олигонуклеотидными зондами для захвата и обнаружения. [ 2 ]
Обычно в случае гибридизации нуклеиновых кислот концентрацию и температуру моновалентной соли контролируют для обеспечения гибридизации и строгости отмывки, в отличие от традиционного ELISA, где концентрация соли обычно фиксируется на стадиях связывания и отмывки (т.е. PBS или TBS). Таким образом, оптимальная концентрация соли в анализах гибридизации варьируется в зависимости от длины и основного состава аналита, зондов захвата и обнаружения.
Конкурентный анализ гибридизации
[ редактировать ]Анализ конкурентной гибридизации [ 3 ] аналогичен традиционному конкурентному иммуноанализу . Как и другие анализы гибридизации, он основан на комплементарности, при которой зонд захвата конкурирует между аналитом и индикатором – меченым олигонуклеотидным аналогом аналита.
Анализ гибридизации-лигирования
[ редактировать ]В анализе гибридизации-лигирования [ 4 ] [ 5 ] зонд-матрица заменяет зонд захвата в сэндвич-анализе для иммобилизации на твердой основе. Матричный зонд полностью комплементарен олигонуклеотидному анализируемому веществу и предназначен для использования в качестве субстрата для лигирования, опосредованного ДНК-лигазой Т4 . Кроме того, зонд-матрица имеет дополнительное растяжение, дополняющее зонд для лигирования, так что зонд для лигирования будет лигироваться на 3'-конце аналита. Несмотря на то, что зонд для лигирования является универсальным, он похож на зонд для обнаружения в том смысле, что он помечен, например, дигоксигенином для последующей передачи сигналов. Строгая промывка с низким содержанием соли или без нее удалит нелигированные продукты.
Связывание аналита с лигирующим зондом делает метод специфичным для 3'-конца аналита, при этом лигирование ДНК-лигазой Т4 гораздо менее эффективно в случае выпуклой петли, что могло бы произойти для версии 3'-метаболита N-1. аналит, например. Специфичность анализа гибридизации-лигирования для лигирования на 3'-конце особенно важна, поскольку преобладающими нуклеазами в крови являются экзонуклеазы с 3' по 5' .
Одним из ограничений метода является то, что он требует наличия свободного гидроксила на 3'-конце, который может быть недоступен, когда, например, к 3'-концу присоединены целевые фрагменты. Кроме того, более экзотический химический состав нуклеиновых кислот с олигонуклеотидными препаратами может влиять на активность лигазы, которую необходимо определять в каждом конкретном случае.
Анализ гибридизации с двойным лигированием
[ редактировать ]
Анализ гибридизации с двойным лигированием (DLA) [ 6 ] расширяет специфичность анализа гибридизации-лигирования до конкретного метода для исходного соединения. Несмотря на надежность, чувствительность и дополнительную специфичность анализа гибридизации-лигирования для 3'-конца аналита-олигонкулеотида, анализ гибридизации-лигирования не является специфичным для 5'-конца аналита.
DLA предназначен для количественного определения только полноразмерного исходного олигонуклеотидного соединения с интактными 5'- и 3'-концами. Зонды DLA лигируются на 5'- и 3'-концах аналита совместным действием ДНК-лигазы Т4 и полинуклеотидкиназы Т4 . Киназа фосфорилирует 5'-конец аналита, и лигаза соединяет зонд захвата с аналитом и зондом обнаружения. Таким образом, зонды захвата и обнаружения в DLA можно назвать зондами лигирования. Что касается анализа гибридизации-лигирования, DLA специфичен для исходного соединения, поскольку эффективность лигирования по выпуклой петле низка, и, таким образом, DLA обнаруживает аналит полной длины как с неповрежденными 5'-, так и с 3'-концами. DLA также можно использовать для определения отдельных метаболитов в биологических матрицах.
Ограничения анализа гибридизации-лигирования также применимы к анализу двойного лигирования, при этом 5'-конец в дополнение к 3'-концу требует наличия свободного гидроксила (или фосфатной группы). Кроме того, ДНК-лигазы Т4 несовместимы с лигированием молекул РНК в качестве донора (т.е. РНК на 5'-конце лигирования). второго поколения Следовательно, антисмысловые антитела , содержащие 2'-O-метил РНК, 2'-O-метоксиэтил или заблокированные нуклеиновые кислоты, могут быть несовместимы с анализом двойного лигирования.
Анализ гибридизации нуклеазы
[ редактировать ]
Анализ гибридизации нуклеазы, [ 7 ] [ 8 ] также называемый нуклеазы S1 анализом разрезания , представляет собой гибридизационный ИФА на основе анализа защиты нуклеазы . В анализе используется нуклеаза S1 , которая расщепляет одноцепочечную ДНК и РНК на олиго- или мононуклеотиды, оставляя нетронутыми двухцепочечную ДНК и РНК.
В анализе гибридизации нуклеазы аналит-олигонуклеотид захватывается на твердой подложке, такой как 96-луночный планшет, с помощью полностью комплементарного режущего зонда. После ферментативной обработки нуклеазой S1 свободный режущий зонд и режущий зонд гибридизуются с метаболитами, т.е. короткими соединениями аналита, разлагаются, что позволяет генерировать сигнал только из полноразмерного дуплекса режущего зонда и аналита.
Этот анализ хорошо толерантен к различным химическим соединениям, примером чего является разработка нуклеазного анализа морфолиноолигонуклеотидов . [ 9 ]
Эта установка для анализа может быть недостаточно надежной и не подходит для валидации в соответствии с рекомендациями FDA по валидации биоаналитических методов . Об этом свидетельствует отсутствие опубликованных методов, которые были бы проверены на соответствие стандартам, установленным FDA для биоаналитических методов.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Ким, Калицыс, Джи Хун, Пол; и др. «Нуклеиновые кислоты: гибридизация» . Уайли . Проверено 4 февраля 2017 г.
{{cite web}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Эфлер, С.М.; Чжан, Л.; Нолл, Бо; Ульманн, Э.; Дэвис, Х.Л. (2005), «Количественное определение олигодезоксинуклеотидов в плазме человека с помощью нового метода гибридизации обеспечивает значительно повышенную чувствительность по сравнению с электрофорезом в капиллярном геле», Oligoнуклеотиды , 15 (2): 119–131, doi : 10.1089/oli.2005.15.119 , ПМИД 15989426
- ^ Деверр, Жан-Робер; Буте, Валери; Буке, Дидье; Эзан, Эрик; Грасси, Жак; Грогнет, Жан-Марк (1997), «Конкурентный анализ ферментативной гибридизации для определения в плазме фосфодиэфирных и фосфоротиоатных антисмысловых олигонуклеотидов», Nucleic Acids Research , 25 (18): 3584–3589, doi : 10.1093/nar/25.18.3584 , PMC 146941 , ПМИД 9278477 [ мертвая ссылка ]
- ^ Деверр, Жан-Робер; Буте, Валери; Буке, Дидье; Эзан, Эрик; Грасси, Жак; Грогнет, Жан-Марк (1997), «Конкурентный анализ ферментативной гибридизации для определения в плазме фосфодиэфирных и фосфоротиоатных антисмысловых олигонуклеотидов», Nucleic Acids Research , 25 (18): 3584–3589, doi : 10.1093/nar/25.18.3584 , PMC 146941 , ПМИД 9278477 [ мертвая ссылка ]
- ^ патент США 6355438 , Бренда Ф. Бейкер; Чжэнгронг Ю и Джанет М. Лидс, «Метод количественного определения олигонуклеотидов», опубликовано 12 марта 2002 г., передано Isis Pharmaceuticals, Inc.
- ^ Трамбле, Гай А.; Халафагян, Гарине; Лего, Джули; Бартлетт, Алан (март 2011 г.), «Анализ гибридизации с двойным лигированием для специфического определения олигонуклеотидной терапии», Bioanalysis , 3 (5): 499–508, doi : 10.4155/bio.11.18 , PMID 21388263
- ^ патент США 8163477 , Чжэнгронг Юй; Бренда Ф. Бейкер и Хунцзян Ву, «Метод обнаружения и количественного определения олигонуклеотидов на основе нуклеазы», опубликовано 24 апреля 2012 г., передано Isis Pharmaceuticals, Inc.
- ^ Сяохуэй, Вэй; Дай, Гуовей; Маркуччи, Гвидо; Лю, Чжунфа; Хойт, Дейл; Блюм, Уильям; Чан, Кеннет К. (2006), «Специфический ИФА-анализ на основе пикомолярной гибридизации для определения фосфоротиоатных олигонуклеотидов в плазме и клеточных матрицах», Pharmaceutical Research , 23 (6): 1251–1264, doi : 10.1007/s11095-006 -0082-3 , ПМИД 16718617 , S2CID 37490274
- ^ Бурки, Умар; Кин, Джонатан; Блейн, Элисон; О'Донован, Лиз; Походка, Майкл Дж.; Лаваль, Стивен Х.; Штрауб, Волкер (2015), «Разработка и применение сверхчувствительного метода ИФА на основе гибридизации для определения пептид-конъюгированных фосфородиамидатных морфолиноолигонуклеотидов», Nucleic Acid Therapeutics , 25 (5): 275–284, doi : 10.1089/nat. 2014.0528 , ЧВК 4576940 , ПМИД 26176274