DO-Seq
FAIRE-Seq выделение — ) формальдегида регуляторных помощью элементов с связанных молекулярной ( метод в биологии , используемый для определения последовательностей участков ДНК в геноме, с регуляторной активностью. [1] Методика была разработана в лаборатории Джейсона Д. Либа в Университете Северной Каролины , Чапел-Хилл. В отличие от DNase-Seq , протокол FAIRE-Seq не требует пермеабилизации клеток или выделения ядер и может анализировать любой тип клеток. В исследовании семи различных типов клеток человека методы DNase-seq и FAIRE-seq дали надежную перекрестную проверку: каждый тип клеток имеет 1-2% человеческого генома в виде открытого хроматина .
Рабочий процесс
[ редактировать ]Протокол основан на том факте, что формальдегидом сшивка нуклеосомами , связанной с более эффективна в ДНК , чем в участках генома, обедненных нуклеосомами. Затем этот метод отделяет несшитую ДНК, которая обычно находится в открытом хроматине, и затем секвенирует. Протокол состоит из перекрестного связывания, экстракции фенолом и секвенирования ДНК в водной фазе.
ДЕЛАТЬ
[ редактировать ]FAIRE использует биохимические свойства связанной с белком ДНК для разделения областей генома, обедненных нуклеосомами. Клетки будут подвергнуты перекрестному сшиванию, обеспечивающему фиксирование взаимодействия между нуклеосомами и ДНК. После обработки ультразвуком фрагментированную и фиксированную ДНК разделяют с помощью фенол-хлороформной экстракции. Этот метод создает две фазы: органическую и водную. Благодаря своим биохимическим свойствам фрагменты ДНК, сшитые с нуклеосомами, будут преимущественно находиться в органической фазе. С другой стороны, в водной фазе обнаруживаются обедненные нуклеосомами или «открытые» области. Путем специфической экстракции водной фазы будут очищены и обогащены только области, обедненные нуклеосомами. [1]
Секвенирование
[ редактировать ]Фрагменты ДНК, извлеченные с помощью FAIRE, можно анализировать с высокой пропускной способностью с использованием методов секвенирования нового поколения . В общем, библиотеки создаются путем лигирования конкретных адаптеров к фрагментам ДНК, что позволяет им группироваться на платформе и амплифицироваться, в результате чего последовательности ДНК считываются/определяются, и это происходит параллельно для миллионов фрагментов ДНК.
В зависимости от размера генома, на котором выполняется FAIRE-seq, требуется минимум чтений для создания соответствующего покрытия данных, гарантирующего возможность определения правильного сигнала. [2] [3] Кроме того, для определения уровня фонового шума часто секвенируют эталонный или входной геном, который не подвергался перекрестным сшивкам.
Обратите внимание, что извлеченные FAIRE-фрагменты можно определить количественно альтернативным методом с использованием количественной ПЦР . Однако этот метод не позволяет проводить полногеномную/высокопроизводительную количественную оценку извлеченных фрагментов.
Чувствительность
[ редактировать ]Существует несколько аспектов FAIRE-seq, которые требуют внимания при анализе и интерпретации данных. Во-первых, было заявлено, что FAIRE-seq будет иметь более высокий охват в энхансерных регионах по сравнению с промоторными. [4] Это контрастирует с альтернативным методом DNase-seq, который, как известно, демонстрирует более высокую чувствительность к областям промотора. Кроме того, было заявлено, что FAIRE-seq отдает предпочтение внутренним интронам и экзонам. [5] В целом также считается, что данные FAIRE-seq отображают более высокий фоновый уровень, что делает этот метод менее чувствительным. [6]
Компьютерный анализ
[ редактировать ]На первом этапе данные FAIRE-seq сопоставляются с эталонным геномом используемого модельного организма.
Далее идентификация геномных областей с открытым хроматином осуществляется с использованием алгоритма вызова пиков. Различные инструменты предлагают пакеты для этого (например, ChIPOTle [7] ЗИНБА [8] и MACS2 [9] ). ChIPOTle использует скользящее окно размером 300 бит для идентификации статистически значимых сигналов. Напротив, MACS2 идентифицирует обогащенный сигнал, комбинируя параметр callpeak с другими опциями, такими как «широкий», «широкий предел», «без модели» или «сдвиг». ZINBA — это универсальный алгоритм обнаружения обогащения в наборе данных короткого чтения. [10] Таким образом, это помогает точно обнаружить сигнал в сложных наборах данных с низким соотношением сигнал/шум.
КроватьИнструменты [11] используется для объединения обогащенных регионов, расположенных близко друг к другу, с образованием CORE (кластера открытых регуляторных элементов). Это помогает идентифицировать доступные области хроматина и закономерности регуляции генов, которые в противном случае были бы невозможно обнаружить, учитывая более низкое разрешение, которое часто приносит с собой FAIRE-seq.
Данные обычно визуализируются в виде дорожек (например, bigWig) и могут быть загружены в браузер генома UCSC. [12]
Основное ограничение этого метода, а именно низкое соотношение сигнал/шум по сравнению с другими анализами доступности хроматина, делает вычислительную интерпретацию этих данных очень сложной. [13]
Альтернативные методы
[ редактировать ]Существует несколько методов, которые можно использовать в качестве альтернативы FAIRE-seq. DNase-seq использует способность фермента ДНКазы I расщеплять свободную/открытую/доступную ДНК для идентификации и секвенирования открытого хроматина. [14] [15] Разработанная впоследствии ATAC-seq использует транспозазу Tn5, которая вставляет определенные фрагменты или транспозоны в доступные области генома для идентификации и секвенирования открытого хроматина. [16]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Гиреси, П.Г.; Ким, Дж; МакДэниел, Р.М.; Айер, ВР; Либ, JD (июнь 2007 г.). «FAIRE (выделение регуляторных элементов с помощью формальдегида) изолирует активные регуляторные элементы из хроматина человека» . Геномные исследования . 17 (6): 877–85. дои : 10.1101/гр.5533506 . ЧВК 1891346 . ПМИД 17179217 .
- ^ Ландт, Стивен Г.; Маринов, Георгий К.; Кундадже, Аншул; Херадпур, Пуя; Паули, Флоренция; Бацоглу, Серафим; Бернштейн, Брэдли Э.; Бикель, Питер; Браун, Джеймс Б. (1 сентября 2012 г.). «Руководство и практика ChIP-seq консорциумов ENCODE и modENCODE» . Геномные исследования . 22 (9): 1813–1831. дои : 10.1101/гр.136184.111 . ISSN 1549-5469 . ПМЦ 3431496 . ПМИД 22955991 .
- ^ Симс, Дэвид; Садбери, Ян; Илотт, Николас Э.; Хегер, Андреас; Понтинг, Крис П. (2014). «Глубина и охват секвенирования: ключевые аспекты геномного анализа». Обзоры природы Генетика . 15 (2): 121–132. дои : 10.1038/nrg3642 . ПМИД 24434847 . S2CID 13325739 .
- ^ Кумар, Вибхор; Муратани, Масафуми; Райан, Нирмала Арул; Краус, Петра; Лафкин, Томас; Нг, Хак Хуэй; Прабхакар, Шьям (1 июля 2013 г.). «Единая, оптимальная обработка сигналов сопоставленных данных глубокого секвенирования» . Природная биотехнология . 31 (7): 615–622. дои : 10.1038/nbt.2596 . ISSN 1546-1696 . ПМИД 23770639 .
- ^ Сун, Линюнь; Чжан, Чжанчэн; Грасфедер, Линда Л.; Бойл, Алан П.; Гирези, Пол Г.; Ли, Бум-Кю; Шеффилд, Натан К.; Греф, Стефан; Хасс, Микаэль (01 октября 2011 г.). «Открытый хроматин, определяемый DNaseI и FAIRE, идентифицирует регуляторные элементы, которые формируют идентичность типа клеток» . Геномные исследования . 21 (10): 1757–1767. дои : 10.1101/гр.121541.111 . ISSN 1088-9051 . ПМК 3202292 . ПМИД 21750106 .
- ^ Цомпана, Мария; Бак, Майкл Дж (20 ноября 2014 г.). «Доступность хроматина: окно в геном» . Эпигенетика и хроматин . 7 (1): 33. дои : 10.1186/1756-8935-7-33 . ПМК 4253006 . ПМИД 25473421 .
- ^ Бак, Майкл Дж; Нобель, Эндрю Б; Либ, Джейсон Д. (1 января 2005 г.). «ChIPOTle: удобный инструмент для анализа данных ChIP-чипа» . Геномная биология . 6 (11): 97 р. дои : 10.1186/gb-2005-6-11-r97 . ISSN 1465-6906 . ПМК 1297653 . ПМИД 16277752 .
- ^ Рашид, Наим У.; Гирези, Пол Г.; Ибрагим, Джозеф Г.; Сунь, Вэй; Либ, Джейсон Д. (1 января 2011 г.). «ZINBA объединяет локальные ковариаты с данными секвенирования ДНК для идентификации широких и узких областей обогащения, даже внутри амплифицированных геномных областей» . Геномная биология . 12 (7): С67. дои : 10.1186/gb-2011-12-7-r67 . ISSN 1474-760X . ПМЦ 3218829 . ПМИД 21787385 .
- ^ Чжан, Юн; Лю, Тао; Мейер, Клиффорд А.; Экхаут, Жером; Джонсон, Дэвид С.; Бернштейн, Брэдли Э.; Нусбаум, Чад; Майерс, Ричард М.; Браун, Майлз (1 января 2008 г.). «Модельный анализ ChIP-Seq (MACS)» . Геномная биология . 9 (9): 137 р. дои : 10.1186/gb-2008-9-9-r137 . ISSN 1474-760X . ПМК 2592715 . ПМИД 18798982 .
- ^ Кухи, Хашем; Даун, Томас А.; Спиваков Михаил; Хаббард, Тим (2014). «Сравнение пиковых вызывающих абонентов, используемых для данных DNase-Seq» . ПЛОС ОДИН . 9 (5): е96303. Бибкод : 2014PLoSO...996303K . дои : 10.1371/journal.pone.0096303 . ПМК 4014496 . ПМИД 24810143 .
- ^ Куинлан, Аарон Р.; Холл, Ира М. (15 марта 2010 г.). «BEDTools: гибкий набор утилит для сравнения геномных признаков» . Биоинформатика . 26 (6): 841–842. doi : 10.1093/биоинформатика/btq033 . ISSN 1367-4803 . ПМЦ 2832824 . ПМИД 20110278 .
- ^ Хинрикс, А.С.; Карольчик Д.; Берч, Р.; Барбер, врач общей практики; Беджерано, Г.; Клоусон, Х.; Диканс, М.; Фьюри, Т.С.; Харт, РА (1 января 2006 г.). «База данных браузера генома UCSC: обновление 2006 г.» . Исследования нуклеиновых кислот . 34 (приложение 1): Д590–Д598. дои : 10.1093/nar/gkj144 . ISSN 0305-1048 . ПМК 1347506 . ПМИД 16381938 .
- ^ Цомпана, М; Бак, MJ (20 ноября 2014 г.). «Доступность хроматина: окно в геном» . Эпигенетика и хроматин . 7 (1): 33. дои : 10.1186/1756-8935-7-33 . ПМК 4253006 . ПМИД 25473421 .
- ^ Бойл, Алан П.; Дэвис, Шон; Шульха, Геннадий П.; Мельцер, Пол; Маргулис, Эллиот Х.; Вэн, Чжипин; Фьюри, Терренс С.; Кроуфорд, Грегори Э. (25 января 2008 г.). «Картирование высокого разрешения и характеристика открытого хроматина по всему геному» . Клетка . 132 (2): 311–322. дои : 10.1016/j.cell.2007.12.014 . ISSN 1097-4172 . ПМЦ 2669738 . ПМИД 18243105 .
- ^ Кроуфорд, Грегори Э.; Холт, Ингеборг Э.; Уиттл, Джеймс; Уэбб, Брин Д.; Тай, Дениз; Дэвис, Шон; Маргулис, Эллиот Х.; Чен, Идун; Бернат, Джон А. (1 января 2006 г.). «Полногеномное картирование сверхчувствительных участков ДНКазы с использованием массово-параллельного сигнатурного секвенирования (MPSS)» . Геномные исследования . 16 (1): 123–131. дои : 10.1101/гр.4074106 . ISSN 1088-9051 . ПМЦ 1356136 . ПМИД 16344561 .
- ^ Буэнростро, Джейсон Д.; Гирези, Пол Г.; Заба, Лиза С.; Чанг, Ховард Ю.; Гринлиф, Уильям Дж. (1 декабря 2013 г.). «Транспозиция нативного хроматина для быстрого и чувствительного эпигеномного профилирования открытого хроматина, ДНК-связывающих белков и положения нуклеосомы» . Природные методы . 10 (12): 1213–1218. дои : 10.1038/nmeth.2688 . ISSN 1548-7105 . ПМЦ 3959825 . ПМИД 24097267 .