SMiLE-Seq

Селективное обогащение лигандами на основе микрофлюидики с последующим секвенированием (SMiLE-seq) представляет собой метод, разработанный для быстрой идентификации специфичности связывания ДНК и сродства полноразмерных мономерных и димерных факторов транскрипции быстрым и полувысокопроизводительным способом.

SMiLE-seq работает путем загрузки in vitro транскрибируемых и транслированных факторов транскрипции «приманки» в микрофлюидное устройство в сочетании с молекулами ДНК . Связанные комплексы транскрипционного фактора и ДНК затем выделяют из устройства, после чего проводят секвенирование, а затем анализ данных секвенирования для характеристики мотивов связывания. Специализированное программное обеспечение используется для определения свойств связывания ДНК мономерных или димерных факторов транскрипции, чтобы помочь предсказать их in vivo активность связывания ДНК .

SMiLE-seq сочетает в себе три важные функции, отличающиеся от существующих методов: (1) использование капиллярных насосов для оптимизации загрузки образцов, (2) улавливание молекулярных взаимодействий на поверхности микрофлюидного устройства посредством иммунозахвата целевых факторов транскрипции, (3) Возможность выбора ДНК, которая специфически связана с факторами транскрипции, из пула случайных последовательностей ДНК . ^{[ 1 ]}

Фон

Выяснение регуляторных механизмов, используемых для управления важными клеточными процессами, является важной отраслью исследований. Клеточные регуляторные сети могут быть очень сложными и часто включают в себя координацию множества процессов, которые начинаются с модуляции экспрессии генов . Связывание молекул транскрипционных факторов с ДНК, отдельно или в сочетании с другими факторами транскрипции, используется для контроля экспрессии генов в ответ как на внутри-, так и на внеклеточные стимулы.

Характеристика механизмов связывания и специфичности факторов транскрипции с конкретными областями ДНК – и идентификация этих факторов транскрипции – является фундаментальным компонентом процесса определения динамики клеточной регуляции. ^{[ 2 ]} До внедрения технологии SMiLE-seq технологии ChIP-seq (иммунопреципитационное секвенирование хроматина) и HT - SELEX (высокопроизводительная систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения) использовались для успешной характеристики почти 500 взаимодействий связывания транскрипционных факторов с ДНК. ^{[ 1 ]}

ChIP-seq использует иммунопреципитацию для выделения специфических факторов транскрипции, связанных с фрагментами ДНК. За иммунопреципитацией следует секвенирование ДНК, которое идентифицирует области генома, с которыми связываются факторы транскрипции. ^{[ 3 ]}
HT-SELEX, аналогичный метод, использует случайные, синтетически сгенерированные молекулы ДНК в качестве приманки для факторов транскрипции in vitro . Предпочтения последовательностей и аффинности связывания характеризуются на основе успешных взаимодействий связывания между молекулами-приманками и факторами транскрипции. ^{[ 4 ]}

Подсчитано, что менее 50% факторов транскрипции, присутствующих у человека, были описаны предыдущими методами. Развитие технологии SMiLE-seq предоставило дополнительный метод, который потенциально может облегчить идентификацию и характеристику ранее неописанных взаимодействий связывания транскрипционного фактора и ДНК. ^{[ 1 ]}

Рабочий процесс SMiLE-seq

SMiLE-seq использует микрофлюидное устройство, в которое загружаются факторы транскрипции, транскрибированные и транслированные in vitro . Образцы транскрипционного фактора (~0,3 нг) модифицируются путем добавления метки усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP) и объединяются как с целевыми двухцепочечными молекулами ДНК (~8 пмоль), меченными цианиновым красителем5 (Cy5), так и с двухцепочечной молекулой ДНК. конкурентная модель ДНК, поли-dIdC, которая действует как отрицательный контроль, ограничивая ложные взаимодействия связывания.

При одновременном анализе нескольких факторов транскрипции (например, при описании потенциальных гетеродимерных связывающих взаимодействий) каждый фактор транскрипции помечается соответствующей уникальной флуоресцентной меткой. Образцы прокачиваются через микрофлюидное устройство в ходе пассивного двадцатиминутного процесса, в котором используется капиллярное действие в ряде параллельных каналов. Факторы транскрипции, меченные eGFP, иммунозахватываются с использованием заякоренных биотинилированных антител против eGFP.

Механическое нажатие кнопки улавливает связанные комплексы транскрипционного фактора-ДНК и проводят флуоресцентный анализ. Флуоресцентные показания, которые идентифицируют наличие нескольких флуоресцентных меток, связанных с одним антителом, указывают на гетеродимерные связывающие взаимодействия. Наличие ДНК подтверждается обнаружением сигнала Cy5. Полидиметилсилоксановая мембрана на поверхности кнопки захватывает успешно связанные комплексы транскрипционного фактора и ДНК, в то время как несвязанные факторы транскрипции и мишени смываются.

После удаления несвязанных компонентов связанные молекулы ДНК собираются, объединяются и амплифицируются. Впоследствии секвенирование выполняется с использованием дорожек секвенирования NextSeq 500 или HiSeq2000. Данные о последовательностях используются для разработки исходной последовательности, которая затем исследуется на наличие функциональных мотивов с использованием уникально разработанного программного конвейера на основе скрытой модели Маркова . ^{[ 1 ]}

Преимущества

Использование микрофлюидики в SMiLE-seq дает три основных преимущества по сравнению с современными методами, используемыми для измерения взаимодействий белок-ДНК (например, ChIP-seq, HT-SELEX и белковые микрочипы ).

SMiLE-seg требует меньше факторов транскрипции, чем другие аналогичные методы (требуются только пикограммы).
Этот процесс происходит быстрее, чем другие методы (на него уходит меньше часа по сравнению с днями).
SMiLE-seq не ограничен длиной целевой ДНК (ограничение микрочипов, связывающих белок ) и не склонен к более сильным взаимодействиям белок-ДНК (основное ограничение HT-SELEX).

Способность многих факторов транскрипции связывать ДНК зависит от образования гетеродимеров и, следовательно, требует присутствия специфического партнера-димера для связывания. Было показано, что это дает неполные результаты, если факторы транскрипции тестируются индивидуально. Было показано, что количество комбинаций гетеродимеров варьируется от 3000 до 25000, и многие из них остаются неохарактеризованными.

Такая технология, как SMiLE-seq, которая способна обнаруживать эти димерные взаимодействия, может помочь расширить текущие знания и охарактеризовать профили связывания транскрипционного фактора с ДНК. Кроме того, в предыдущих технологиях использовались зонды факторов транскрипции в их усеченной форме, что могло снизить их способность связываться и димеризоваться. SMiLE-seq позволяет надежно идентифицировать специфичность связывания ДНК полноразмерных, ранее не охарактеризованных факторов транскрипции. Более того, SMiLE-seq способен идентифицировать сайты связывания транскрипционных факторов в широком диапазоне аффинностей связывания, что представляет собой значительное ограничение других технологий.

Ограничения

Основное ограничение SMiLE-seq заключается в том, что этот метод можно использовать только для характеристики связывающих взаимодействий ранее идентифицированных факторов транскрипции, поскольку метод требует транскрипции и трансляции факторов транскрипции in vitro до их комбинации с молекулами ДНК. Кроме того, предыдущие исследования показали, что флуоресцентные белковые метки могут влиять на аффинность связывания белков с их мишенями. ^{[ 5 ]}

Необходимо будет изучить влияние специфических меток флуоресцентного белка на аффинность связывания, чтобы определить, повлияет ли это на специфические взаимодействия белок-ДНК, обнаруженные с помощью этой технологии. Дальнейшее развитие SMiLE-seq может включать изменение условий экспрессии факторов транскрипции для повышения успеха анализа. ^{[ 1 ]}

См. также

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Исакова А; Гру, Р; Имбо, М; Райнер, П; Альперн, Д; Дайнесе, Р; Амброзини, Дж; Троно, Д; Бухер, П; Депланке, Б (2017). «SMiLE-seq идентифицирует мотивы связывания одиночных и димерных факторов транскрипции». Природные методы . 14 (3): 316–322. дои : 10.1038/nmeth.4143 . ПМИД 28092692 . S2CID 4095362 .
^ Митчелл, ПиДжей; Тцзян, Р. (1989). «Регуляция транскрипции в клетках млекопитающих». Наука . 245 (4916): 371–378. Бибкод : 1989Sci...245..371M . дои : 10.1126/science.2667136 . ПМИД 2667136 .
^ Парк, Пи Джей (2009). «ЧИП-сек: преимущества и проблемы развивающейся технологии» . Обзоры природы Генетика . 10 (10): 669–680. дои : 10.1038/nrg2641 . ПМК 3191340 . ПМИД 19736561 .
^ Стормо, Джорджия; Чжао, Ю (2010). «Определение специфичности белок-ДНК-взаимодействий». Обзоры природы Генетика . 11 (11): 751–760. дои : 10.1038/nrg2845 . ПМИД 20877328 . S2CID 205484733 .
^ Сунь, Юнг-Шин (2009). «Влияние флуоресцентно меченых белковых зондов на кинетику белок-лигандных реакций» . Ленгмюр . 24 (23): 13399–13405. дои : 10.1021/la802097z . ПМК 2721158 . ПМИД 18991423 .

[SMiLE-seq-1] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Исакова А; Гру, Р; Имбо, М; Райнер, П; Альперн, Д; Дайнесе, Р; Амброзини, Дж; Троно, Д; Бухер, П; Депланке, Б (2017). «SMiLE-seq идентифицирует мотивы связывания одиночных и димерных факторов транскрипции». Природные методы . 14 (3): 316–322. дои : 10.1038/nmeth.4143 . ПМИД 28092692 . S2CID 4095362 .

[transcription-2] Митчелл, ПиДжей; Тцзян, Р. (1989). «Регуляция транскрипции в клетках млекопитающих». Наука . 245 (4916): 371–378. Бибкод : 1989Sci...245..371M . дои : 10.1126/science.2667136 . ПМИД 2667136 .

[ChIP-seq-3] Парк, Пи Джей (2009). «ЧИП-сек: преимущества и проблемы развивающейся технологии» . Обзоры природы Генетика . 10 (10): 669–680. дои : 10.1038/nrg2641 . ПМК 3191340 . ПМИД 19736561 .

[HT-SELEX-4] Стормо, Джорджия; Чжао, Ю (2010). «Определение специфичности белок-ДНК-взаимодействий». Обзоры природы Генетика . 11 (11): 751–760. дои : 10.1038/nrg2845 . ПМИД 20877328 . S2CID 205484733 .

[Binding_Affinity-5] Сунь, Юнг-Шин (2009). «Влияние флуоресцентно меченых белковых зондов на кинетику белок-лигандных реакций» . Ленгмюр . 24 (23): 13399–13405. дои : 10.1021/la802097z . ПМК 2721158 . ПМИД 18991423 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]