Модели изогенных заболеваний человека

Модели изогенных заболеваний человека представляют собой семейство клеток, отобранных или сконструированных для точного моделирования генетики конкретной популяции пациентов in vitro . Им предоставляют генетически подобранную «нормальную клетку», чтобы создать изогенную систему для исследования биологии заболеваний и новых терапевтических агентов. Их можно использовать для моделирования любого заболевания, имеющего генетическую основу. Рак является одним из таких заболеваний, для которого широко используются модели изогенных заболеваний человека.

Исторические модели

Модели изогенных заболеваний человека сравнивают с «пациентами в пробирке», поскольку они включают в себя новейшие исследования генетических заболеваний человека и делают это без трудностей и ограничений, связанных с использованием нечеловеческих моделей.

Исторически клетки, полученные от животных, обычно мышей, использовались для моделирования путей, связанных с раком. Однако существуют очевидные ограничения, присущие использованию животных для моделирования генетически детерминированных заболеваний у человека. Несмотря на значительную степень генетической консервативности между людьми и мышами, существуют значительные различия между биологией мышей и людей, которые важны для исследований рака. Например, существенные различия в регуляции теломер позволяют мышиным клеткам обойти потребность в повышении регуляции теломеразы , что является этапом, ограничивающим скорость формирования рака у человека. Другой пример: некоторые взаимодействия лиганд-рецептор несовместимы между мышами и людьми. Кроме того, эксперименты продемонстрировали важные и существенные различия в способности трансформировать клетки по сравнению с клетками мышиного происхождения. По этим причинам по-прежнему важно разрабатывать модели рака, в которых используются человеческие клетки.

Векторы таргетинга

Изогенные клеточные линии создаются с помощью процесса, называемого гомологичным генным нацеливанием. Направляющие векторы, использующие гомологичную рекомбинацию, представляют собой инструменты или методы, которые используются для нокаута или нокаута желаемой вызывающей заболевание мутации или SNP ( однонуклеотидного полиморфизма ), подлежащего изучению. Хотя мутации заболевания можно получить непосредственно от больных раком, эти клетки обычно содержат множество фоновых мутаций в дополнение к конкретной интересующей мутации, и соответствующая нормальная клеточная линия обычно не получается. Впоследствии нацеливающие векторы используются для « нокаута » или « нокаута » генных мутаций, позволяющих переключиться в обоих направлениях; от нормального генотипа к раковому; или наоборот; в охарактеризованных линиях раковых клеток человека, таких как HCT116 или Nalm6.

Существует несколько технологий генного таргетинга, используемых для создания желаемой мутации, наиболее распространенные из которых кратко описаны, включая ключевые преимущества и ограничения, в сводной таблице ниже.

Техника	Джин Нокаин	Джин нокаут
rAAV (рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы)	Целевые вставки или модификации создаются внутри эндогенных генов; и поэтому подлежат: Правильные механизмы генной регуляции; и Точно отражают события заболевания, обнаруженные у реальных пациентов. rAAV может с высокой эффективностью вводить тонкие точечные мутации, SNP, а также небольшие вставки. Более того, многие рецензируемые исследования показали, что rAAV не вызывает каких-либо искажающих целевых геномных событий. Похоже, что это предпочтительный метод, принятый в научных кругах, биотехнологиях и фармацевтике с точки зрения точности, времени и стоимости. |	Нокауты генов происходят в эндогенном локусе и, таким образом, являются окончательными, стабильными и актуальными для пациента. Никаких мешающих нецелевых эффектов в других геномных локусах не возникает. Это требует двухэтапного процесса: Создайте гетерозиготный КО Создайте биаллельный нокаут, нацеливаясь на второй аллель. Таким образом, этот процесс может генерировать 3 генотипа (+/+; -/+ и -/-); что позволяет, таким образом, анализировать функцию гаплонедостаточного гена. Текущим ограничением является необходимость последовательного воздействия на отдельные аллели, что делает создание нокаутных клеточных линий двухэтапным процессом.|
Гомологичная рекомбинация на основе плазмид	Вставка осуществляется в эндогенном локусе и имеет все вышеперечисленные преимущества, но она очень неэффективна. Это также требует стратегии выбора лекарств без промотора, влекущей за собой создание индивидуальных конструкций. С помощью этого метода был создан большой исторический банк клеточных линий, который с середины 1990-х годов был вытеснен другими методами.	Делеция происходит в эндогенном локусе и имеет все вышеперечисленные преимущества, но она неэффективна. Это также требует стратегии выбора лекарств без промотора, которая влечет за собой создание индивидуальных конструкций.
Флип-ин	Это эффективный метод, который позволяет направленно вставлять «эктопические» трансгены в один заранее определенный геномный локус (интеграция через сайт рекомбиназы FLP ). Это не метод модификации эндогенного локуса. Трансгены обычно находятся под контролем экзогенного промотора или частично определенной промоторной единицы в неправильном геномном местоположении. Поэтому их экспрессия не будет находиться под той же геномной и эпигенетической регуляцией, что и эндогенные локусы, что ограничивает полезность этих систем для изучения функции генов. Однако они хороши для индукции быстрой и стабильной экспрессии экзогенных генов.	Непригодный
Нуклеазы цинковых пальцев (ZFN)	Сообщается, что ZFN достигают высоких показателей генетического нокаута целевого эндогенного гена. Если ZFN доставляют совместно с трансгенной конструкцией, гомологичной целевому гену, также можно добиться генетического нокаина или инсерции. Одним из потенциальных недостатков является то, что любые нецелевые двухцепочечные разрывы могут привести к случайным вставкам и делециям нецелевых генов и более широкой геномной нестабильности; смешивая полученный генотип. Однако не наблюдалось измеримого увеличения скорости случайной интеграции плазмид в клетках человека, эффективно отредактированных с помощью ZFN, нацеленных на составной сайт узнавания длиной 24 п.о.	ZFN представляют собой эндонуклеазы, направленные на последовательность, которые позволяют быстро и высокоэффективно (до 90% в общей популяции клеток) разрушать обе аллели целевого гена, хотя об изменениях потери функции, определяемых пользователем или относящихся к пациенту, не сообщалось. аналогичные частоты. Серьезную озабоченность вызывают нецелевые делеции или вставки в других частях генома. Преимущество в скорости получения двуаллельного КО за один этап также частично нивелируется, если все еще необходимо получить клональную клеточную линию для изучения функции гена в гомогенной клеточной популяции.
Мегануклеазы	Мегануклеазы функционально аналогичны ZFN. Существуют ограничения, присущие их использованию, например, создание вектора мегануклеазы, которое может занять до 9 месяцев и стоить десятки тысяч долларов. Это делает мегануклеазы более привлекательными для таких важных приложений, как генная терапия, агробиотехнология и создание линий биопродуцентов.

Гомологичная рекомбинация в моделях раковых клеток

Гомологичная рекомбинация (HR) — это разновидность генетической рекомбинации, при которой генетические последовательности обмениваются между двумя схожими сегментами ДНК. HR играет важную роль в делении эукариотических клеток, способствуя генетическому разнообразию посредством обмена между соответствующими сегментами ДНК для создания новых и потенциально полезных комбинаций генов.

HR выполняет вторую жизненно важную роль в восстановлении ДНК, обеспечивая восстановление двухцепочечных разрывов ДНК, что является обычным явлением в течение жизненного цикла клетки. Именно этот процесс искусственно запускается с помощью вышеупомянутых технологий и загружается для того, чтобы вызвать «нок-ины» или «нокауты» в определенных генах 5, 7.

Недавнее ключевое достижение было обнаружено с использованием векторов рекомбинации, гомологичных AAV, которые увеличивают низкие естественные показатели HR в дифференцированных клетках человека в сочетании с векторами-последовательностями, нацеленными на гены.

• 
  Схема типичного вектора rAAV (источник: https://www.horizondiscovery.com/gene-editing/raav )

Коммерциализация

Факторы, которые привели к недавней коммерциализации моделей изогенных раковых клеток человека для фармацевтической промышленности и исследовательских лабораторий, имеют двоякое значение.

Во-первых, успешное патентование векторной технологии с улучшенным нацеливанием обеспечило основу для коммерциализации клеточных моделей, возникающих в результате применения этих технологий.

Во-вторых, тенденция относительно низких показателей успеха в фармацевтических исследованиях и огромных затратах создала реальную потребность в новых исследовательских инструментах, которые позволяют определить, как подгруппы пациентов будут положительно реагировать или быть устойчивыми к таргетным противоопухолевым препаратам на основе их индивидуального генетического профиля.

См. также

• ААВ
• Рекомбинация FLP-FRT
• Геномная инженерия
• Гомологичная рекомбинация
  • в вирусах
  • Технологические приложения
  • Терапия рака
• Плазмида
• Рекомбинантная геномная инженерия, опосредованная AAV
• Синтетическая летальность
• Нуклеаза цинковых пальцев

Источники

• Барделли А. , Парсонс Д.В., Силлиман Н. и др. (май 2003 г.). «Мутационный анализ тирозинового кинома при колоректальном раке». Наука . 300 (5621): 949. doi : 10.1126/science.1082596 . ПМИД   12738854 . S2CID   85934154 .
• Кохли М., Раго С., Ленгауэр С., Кинцлер К.В., Фогельштейн Б. (2004). «Простые методы создания нокаутов генов соматических клеток человека с использованием рекомбинантных аденоассоциированных вирусов» . Нуклеиновые кислоты Рез . 32 (1): 3д–3. дои : 10.1093/нар/gnh009 . ПМЦ   373311 . ПМИД   14704360 .
• Ван З., Шен Д., Парсонс Д.В. и др. (май 2004 г.). «Мутационный анализ тирозинового фосфатома при колоректальном раке». Наука . 304 (5674): 1164–6. Бибкод : 2004Sci...304.1164W . дои : 10.1126/science.1096096 . ПМИД   15155950 . S2CID   2974833 .
• Топалоглу О, Херли П.Дж., Йылдирим О, Чивин С.И., Бунц Ф. (2005). «Улучшенные методы создания нокаутных и нокаутных клеточных линий человека» . Нуклеиновые кислоты Рез . 33 (18): е158. дои : 10.1093/нар/гни160 . ПМЦ   1255732 . ПМИД   16214806 .
• Морони М., Сарторе-Бьянки А., Бенвенути С., Артале С., Барделли А., Сиена С. (ноябрь 2005 г.). «Соматическая мутация каталитического домена EGFR и лечение гефитинибом при колоректальном раке» . Энн. Онкол . 16 (11): 1848–9. дои : 10.1093/annonc/mdi356 . ПМИД   16012179 .
• Ди Николантонио Ф, Барделли А (январь 2006 г.). «Киназные мутации при раке: бреши в броне врага?». Curr Opin Oncol . 18 (1): 69–76. дои : 10.1097/01.cco.0000198020.91724.48 . ПМИД   16357567 . S2CID   25857889 .
• Бенвенути С., Сарторе-Бьянки А., Ди Николантонио Ф. и др. (март 2007 г.). «Онкогенная активация сигнального пути RAS/RAF ухудшает реакцию метастатического колоректального рака на терапию антителами к рецептору эпидермального фактора роста» . Рак Рез . 67 (6): 2643–8. дои : 10.1158/0008-5472.CAN-06-4158 . ПМИД   17363584 .
• Арена S, Писакан А, Маццоне М, Комольо ПМ, Барделли А (июль 2007 г.). «Генетическое нацеливание киназной активности рецептора Met в раковых клетках» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 104 (27): 11412–7. Бибкод : 2007PNAS..10411412A . дои : 10.1073/pnas.0703205104 . ПМК   2040912 . ПМИД   17595299 .
• Кониши Х., Каракас Б., Абухдейр А.М. и др. (сентябрь 2007 г.). «Нокаут мутантного K-ras в нетканогенных эпителиальных клетках человека как новая модель для изучения трансформации, опосредованной K-ras» . Рак Рез . 67 (18): 8460–7. дои : 10.1158/0008-5472.CAN-07-0108 . ПМИД   17875684 .
• Арена S, Изелла C, Мартини М, де Марко А, Медико Е, Барделли А (сентябрь 2007 г.). «Нокинг онкогенного Kras не трансформирует соматические клетки мыши, но запускает транскрипционный ответ, который классифицирует рак человека» . Рак Рез . 67 (18): 8468–76. дои : 10.1158/0008-5472.CAN-07-1126 . ПМИД   17875685 .
• Грим Дж.Э., Густафсон М.П., ​​Хирата Р.К. и др. (июнь 2008 г.). «Деградация субстрата, зависящая от изоформы и клеточного цикла, с помощью убиквитинлигазы Fbw7» . Дж. Клеточная Биол . 181 (6): 913–20. дои : 10.1083/jcb.200802076 . ПМК   2426948 . ПМИД   18559665 .
• Фаттах Ф.Дж., Лихтер Н.Ф., Фаттах КР, О С., Хендриксон Э.А. (июнь 2008 г.). «Ku70, важный ген, модулирует частоту нацеливания генов, опосредованных rAAV, в соматические клетки человека» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 105 (25): 8703–8. Бибкод : 2008PNAS..105.8703F . дои : 10.1073/pnas.0712060105 . ПМК   2438404 . ПМИД   18562296 .
• Ди Николантонио Ф., Мартини М., Молинари Ф. и др. (декабрь 2008 г.). «BRAF дикого типа необходим для ответа на панитумумаб или цетуксимаб при метастатическом колоректальном раке» . Дж. Клин. Онкол . 26 (35): 5705–12. дои : 10.1200/JCO.2008.18.0786 . hdl : 2434/349662 . ПМИД   19001320 . Архивировано из оригинала 15 апреля 2013 г.
• Ди Николантонио Ф, Арена С, Галликкио М и др. (декабрь 2008 г.). «Замена нормальных аллелей мутантными в геноме нормальных клеток человека раскрывает специфичные для мутаций реакции на лекарства» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 105 (52): 20864–9. Бибкод : 2008PNAS..10520864D . дои : 10.1073/pnas.0808757105 . ПМЦ   2634925 . ПМИД   19106301 .
• Гастин Дж.П., Каракас Б., Вайс М.Б. и др. (февраль 2009 г.). «Нокаут мутанта PIK3CA активирует множество онкогенных путей» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 106 (8): 2835–40. Бибкод : 2009PNAS..106.2835G . дои : 10.1073/pnas.0813351106 . ПМЦ   2636736 . ПМИД   19196980 .
• Сарторе-Бьянки А., Мартини М., Молинари Ф. и др. (март 2009 г.). «Мутации PIK3CA при колоректальном раке связаны с клинической резистентностью к моноклональным антителам, нацеленным на EGFR» . Рак Рез . 69 (5): 1851–7. дои : 10.1158/0008-5472.CAN-08-2466 . ПМИД   19223544 .
• Сур С., Пальярини Р., Бунц Ф. и др. (март 2009 г.). «Панель изогенных раковых клеток человека предлагает терапевтический подход к лечению рака с инактивированным р53» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 106 (10): 3964–9. Бибкод : 2009PNAS..106.3964S . дои : 10.1073/pnas.0813333106 . ПМК   2656188 . ПМИД   19225112 .
• Юн Дж., Раго С., Чеонг И. и др. (сентябрь 2009 г.). «Депривация глюкозы способствует развитию мутаций пути KRAS в опухолевых клетках» . Наука . 325 (5947): 1555–9. Бибкод : 2009Sci...325.1555Y . дои : 10.1126/science.1174229 . ПМК   2820374 . ПМИД   19661383 .
• Сарторе-Бьянки А., Ди Николантонио Ф., Никелатти М. и др. (2009). Кордес Н. (ред.). «Мультидетерминантный анализ молекулярных изменений для прогнозирования клинической пользы моноклональных антител, нацеленных на EGFR, при колоректальном раке» . ПЛОС ОДИН . 4 (10): е7287. Бибкод : 2009PLoSO...4.7287S . дои : 10.1371/journal.pone.0007287 . ПМЦ   2750753 . ПМИД   19806185 .
• Эндогенная экспрессия онкогенной мутации PI3K приводит к активации передачи сигналов PI3K, и плакат с инвазивным фенотипом представлен на выставке AACR/EORTC Molecular Targets and Cancer Therapeutics, Бостон, США, ноябрь 2009 г.
• Барделли А., Сиена С. (март 2010 г.). «Молекулярные механизмы устойчивости к цетуксимабу и панитумумабу при колоректальном раке» . Дж. Клин. Онкол . 28 (7): 1254–61. дои : 10.1200/JCO.2009.24.6116 . ПМИД   20100961 . Архивировано из оригинала 15 апреля 2013 г.
• Фаттах Ф., Ли Э.Х., Вайзенсель Н., Ван Ю., Лихтер Н., Хендриксон Э.А. (февраль 2010 г.). Пирсон CE (ред.). «Ku регулирует выбор негомологичного пути соединения концов для восстановления двухцепочечного разрыва ДНК в соматических клетках человека» . ПЛОС Генет . 6 (2): e1000855. дои : 10.1371/journal.pgen.1000855 . ПМК   2829059 . ПМИД   20195511 .
• Бурон Н., Порседду М., Брабант М. и др. (2010). Азиз С.А. (ред.). «Использование митохондрий линий раковых клеток человека для изучения механизмов пептидов BH3 и ABT-737-индуцированной проницаемости митохондриальных мембран» . ПЛОС ОДИН . 5 (3): e9924. Бибкод : 2010PLoSO...5.9924B . дои : 10.1371/journal.pone.0009924 . ПМЦ   2847598 . ПМИД   20360986 .
• Эндогенная экспрессия онкогенной мутации PI3K приводит к накоплению антиапоптотических белков в митохондриях. Плакат, представленный на конференции AACR 2010, Вашингтон, округ Колумбия, США, апрель. 2010 год
• Использование изогенных клеточных линий «X-MAN» для определения профилей активности ингибитора PI3-киназы. Плакат, представленный на конференции AACR 2010, Вашингтон, округ Колумбия, США, апрель. 2010 год
• Использование мутанта PI3CA «X-MAN» увеличивает экспрессию отдельных изоформ тубулина и способствует устойчивости к антимитотическим химиотерапевтическим препаратам. Плакат представлен на конференции AACR 2010, Вашингтон, округ Колумбия, США, апрель. 2010 год
• Ди Николантонио Ф, Арена С, Табернеро Дж и др. (август 2010 г.). «Нарушение регуляции сигнальных путей PI3K и KRAS в раковых клетках человека определяет их реакцию на эверолимус» . Дж. Клин. Инвестируйте . 120 (8): 2858–66. дои : 10.1172/JCI37539 . ПМЦ   2912177 . ПМИД   20664172 .