Анализ хемотаксиса
Анализы хемотаксиса представляют собой экспериментальные инструменты для оценки хемотаксической способности прокариотических или эукариотических клеток. Разработано большое разнообразие методик. Некоторые методы являются качественными , позволяя исследователю приблизительно определить хемотаксическое сродство клетки к аналиту, тогда как другие являются количественными , позволяя точно измерить это сродство.
Контроль качества
[ редактировать ]В общем, наиболее важным требованием является калибровка времени инкубации анализа как для модельной клетки, так и для оцениваемого лиганда. Слишком короткое время инкубации приводит к отсутствию клеток в образце, тогда как слишком длительное время нарушает градиенты концентрации и измеряет скорее хемокинетические , чем хемотаксические реакции.
Наиболее часто используемые методы сгруппированы в две основные группы:
Методы агаровой пластинки
[ редактировать ]
Этот способ оценки касается агар-агара или желатина, содержащих полутвердые слои, приготовленные перед экспериментом. В слое вырезают небольшие лунки и заполняют их клетками и тестируемым веществом. Клетки могут мигрировать в направлении химического градиента как в полутвердом слое, так и под ним. Некоторые варианты методики касаются также скважин и параллельных каналов, соединенных разрезом в начале эксперимента (ПП-методика). Радиальное расположение ПП-методики (3 и более каналов) дает возможность сравнивать хемотаксическую активность разных популяций клеток или изучать предпочтения между лигандами. [ 1 ]
Подсчет клеток: клетки-положительные ответы можно подсчитывать с передней части мигрирующих клеток, после окрашивания или в нативных условиях в световом микроскопе.
Двухкамерные методы
[ редактировать ]
Камера Бойдена
[ редактировать ]Камеры, изолированные фильтрами, являются подходящим инструментом для точного определения хемотаксического поведения. Первопроходческий тип этих камер был построен Бойденом. [ 2 ] Подвижные клетки помещаются в верхнюю камеру, а жидкость, содержащая тестируемое вещество, заливается в нижнюю. Размер исследуемых подвижных клеток определяет размер пор фильтра; важно выбрать диаметр, обеспечивающий активную трансмиграцию. Для моделирования условий in vivo некоторые протоколы предпочитают покрытие фильтра молекулами внеклеточного матрикса ( коллаген , эластин и т. д.). Эффективность измерений была повышена за счет разработки многолуночных камер (например, NeuroProbe), в которых оцениваются 24, 96, 384 образца в режиме in vivo. параллельно. Преимущество этого варианта в том, что анализируется несколько параллелей в одинаковых условиях.
Мостовые камеры
[ редактировать ]В другом варианте камеры соединены бок о бок горизонтально (камера Зигмонда). [ 3 ] или в виде концентрических колец на предметном стекле (камера Данна) [ 4 ] Градиент концентрации развивается на узкой соединительной перемычке между камерами, а количество мигрирующих клеток также подсчитывается на поверхности перемычки с помощью светового микроскопа. В некоторых случаях перемычка между двумя камерами заполнена агаром, и клеткам приходится « скользить » в этом полутвердом слое.
Капиллярные методы
[ редактировать ]Некоторые капиллярные методы также предусматривают расположение камеры, однако между клетками и тестируемым веществом нет фильтра. [ 5 ] Количественные результаты достигаются с помощью многолуночного типа этого зонда с использованием 4-8-12-канальных пипеток. Точность пипетки и увеличенное количество параллельных проб являются большим преимуществом этого теста. [ 6 ]
Подсчет клеток: клетки-положительные ответчики подсчитываются из нижней камеры (длительное время инкубации) или из фильтра (короткое время инкубации). Для обнаружения клеток общие методы окрашивания (например, трипановым синим используются ) или специальные зонды (например, обнаружение мт-дегидрогеназы с помощью МТТ-анализа). Также используются меченые (например, флуорохромами ) клетки, в некоторых анализах клетки метятся во время трансмиграции через фильтр.
Другие методы
[ редактировать ]
Помимо вышеупомянутых двух наиболее часто используемых семейств методов, был разработан широкий спектр протоколов для измерения хемотаксической активности. Некоторые из них являются только качественными, например, тесты на агрегацию, когда на предметное стекло помещают небольшие кусочки агара или фильтров и измеряют накопление клеток вокруг них.
В другом полуколичественном методе клетки накладывают на тестируемое вещество и регистрируют изменения опалесценции первоначально бесклеточного компартмента в течение времени инкубации. [ 7 ]
Третьим часто используемым качественным методом является Т-образный лабиринт и его адаптации для микропланшетов. В оригинальном варианте контейнер, просверленный в колышке, наполнен клетками. Затем колышек закручивается и клетки соприкасаются с двумя другими контейнерами, наполненными разными веществами. Инкубацию останавливают переустановкой колышка и подсчитывают количество клеток в контейнерах. [ 8 ]
Также в последнее время [ когда? ] Микрофлюидные устройства используются все чаще и чаще для количественного и точного тестирования хемотаксиса. [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Кодидай Л. (1995). «Метод определения хемоаттрактации у Tetrahymenapyriformis». Карр Микробиол . 30 (4): 251–3. дои : 10.1007/BF00293642 . PMID 7765899 . S2CID 28989380 .
- ^ Бойден, С.В. (1962). «Хемотаксическое действие смесей антител и антигенов на полиморфно-ядерные лейкоциты» . Джей Эксп Мед . 115 (3): 453–66. дои : 10.1084/jem.115.3.453 . ПМК 2137509 . ПМИД 13872176 .
- ^ Зигмонд С.Х. (1977). «Способность полиморфно-ядерных лейкоцитов ориентироваться в градиентах хемотаксических факторов» . Журнал клеточной биологии . 75 (2): 606–616. CiteSeerX 10.1.1.336.4181 . дои : 10.1083/jcb.75.2.606 . ПМК 2109936 . ПМИД 264125 .
- ^ Зича Д.; Данн Г.А.; Браун А.Ф. (1991). «Новая камера хемотаксиса с прямым обзором». J Cell Sci . 99 (4): 769–75. дои : 10.1242/jcs.99.4.769 . ПМИД 1770004 .
- ^ Лейк В.; Хелле Дж. (1983). «Количественный анализ хемотаксиса инфузорий». Анальная биохимия . 135 (2): 466–9. дои : 10.1016/0003-2697(83)90713-3 . ПМИД 6660520 .
- ^ Кодидай Л., Лемберковиц Э. и Чаба, Г. (1995). «Молекулозависимые хемотаксические реакции Tetrahymenapyriformis, вызванные летучими маслами». Акта Протозоол . 34 : 181–5.
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Коппельхус У.; Хеллунг-Ларсен П.; Лейк В. (1994). «Улучшенный количественный анализ хемокинеза у тетрахимены» . Биол Булл . 187 (1): 8–15. дои : 10.2307/1542160 . JSTOR 1542160 . ПМИД 7918798 .
- ^ Ван Хаутен Дж.; Мартель Э.; Каш Т. (1982). «Кинетический анализ хемокинеза Paramecium». Дж Протозоол . 29 (2): 226–30. дои : 10.1111/j.1550-7408.1982.tb04016.x . ПМИД 7097615 .
- ^ Сеймур-младший; Дж. Р. Ахмед; Маркос С.Р. (2008). «Микрофлюидный анализ хемотаксиса для изучения поведения микробов при диффузии питательных веществ». Лимнология и океанография: Методы . 6 (9): 477–887. Бибкод : 2008LimOM...6..477S . дои : 10.4319/лом.2008.6.477 . hdl : 10453/8517 . S2CID 10730867 .
- ^ Чжан С.; {\i{}и др.} (2013). «Чувствительный анализ хемотаксиса с использованием нового микрофлюидного устройства». {\i{}BioMed Research International} . 8 : 8211–8.
- ^ Ахмед Т.; Химизу ТС; Стокер Р. (2010). «Микрофлюидика для бактериального хемотаксиса» . {\i{}Интегративная биология} . 2 (11–12): 604–29. дои : 10.1039/c0ib00049c . hdl : 1721.1/66851 . ПМИД 20967322 .