Метаболическая инженерия

Метаболическая инженерия — это практика оптимизации генетических и регуляторных процессов внутри клеток для увеличения производства клеткой определенного вещества. Эти процессы представляют собой химические сети, в которых используется ряд биохимических реакций и ферментов , которые позволяют клеткам преобразовывать сырье в молекулы, необходимые для выживания клетки. Метаболическая инженерия стремится математически смоделировать эти сети, рассчитать выход полезных продуктов и определить части сети, которые ограничивают производство этих продуктов. ^[1] Затем можно использовать методы генной инженерии для модификации сети и устранения этих ограничений. И снова эту модифицированную сеть можно смоделировать для расчета выхода нового продукта.

Конечная цель метаболической инженерии — иметь возможность использовать эти организмы для производства ценных веществ в промышленных масштабах экономически эффективным способом. Текущие примеры включают производство пива , вина , сыра , фармацевтических препаратов и других биотехнологических продуктов. ^[2] Другая возможная область использования – разработка масличных культур, состав которых модифицирован для повышения их пищевой ценности. ^[3] Некоторые из распространенных стратегий, используемых для метаболической инженерии, включают (1) сверхэкспрессию гена, кодирующего фермент, ограничивающий скорость биосинтетического пути, (2) блокирование конкурирующих метаболических путей, (3) экспрессию гетерологичных генов и (4) ферментную инженерию. ^[4]

Поскольку клетки используют эти метаболические сети для своего выживания, изменения могут иметь радикальные последствия для жизнеспособности клеток. Таким образом, в метаболической инженерии возникают компромиссы между способностью клеток производить желаемое вещество и их естественными потребностями выживания. Поэтому вместо прямого удаления и/или сверхэкспрессии генов, кодирующих метаболические ферменты, в настоящее время основное внимание уделяется регуляторным сетям в клетке для эффективного управления метаболизмом. ^[5]

История и приложения

Клеточный метаболизм можно оптимизировать для промышленного использования.

В прошлом, чтобы увеличить продуктивность желаемого метаболита , микроорганизм генетически модифицировали путем химически индуцированной мутации мутантный штамм , который сверхэкспрессировал желаемый метаболит. , а затем выбирали ^[6] Однако одна из основных проблем этого метода заключалась в том, что метаболический путь производства этого метаболита не анализировался, и в результате были неизвестны ограничения на производство и соответствующие ферменты пути, которые необходимо было модифицировать. ^[6]

В 1990-х годах появился новый метод, названный метаболической инженерией. Этот метод анализирует метаболический путь микроорганизма и определяет ограничения и их влияние на производство желаемых соединений. Затем для снятия этих ограничений используется генная инженерия. Некоторыми примерами успешной метаболической инженерии являются следующие: (i) Выявление ограничений на выработку лизина в Corynebacterium glutamicum и вставка новых генов для снятия этих ограничений и улучшения производства. ^[7] (ii) Разработка нового пути биосинтеза жирных кислот , называемого путем обратного бета-окисления , который более эффективен, чем природный путь, в производстве жирных кислот и спиртов, которые потенциально могут быть каталитически преобразованы в химические вещества и топливо. ^[8] (iii) Улучшение производства DAHP, ароматического метаболита, продуцируемого E. coli , который является промежуточным продуктом в производстве ароматических аминокислот. ^[9] С помощью анализа метаболического потока было установлено, что теоретический максимальный выход DAHP на использованную молекулу глюкозы составлял 3/7. Это связано с тем, что часть углерода глюкозы теряется в виде углекислого газа, а не используется для производства DAHP. Кроме того, один из метаболитов (PEP или фосфоенолпируват ), который используется для производства DAHP, превращался в пируват (PYR) для транспортировки глюкозы в клетку и, следовательно, больше не был доступен для производства DAHP. Чтобы восполнить нехватку PEP и повысить урожайность, Patnaik et al. использовали генную инженерию на E. coli , чтобы ввести реакцию, которая превращает PYR обратно в PEP. Таким образом, PEP, используемый для транспортировки глюкозы в клетку, регенерируется и может быть использован для производства DAHP. Это привело к новому теоретическому максимальному выходу 6/7 – вдвое больше, чем у нативной системы E. coli .

В промышленном масштабе метаболическая инженерия становится все более удобной и экономически эффективной. По данным Организации биотехнологической промышленности , «более 50 предприятий по биопереработке строятся по всей Северной Америке для применения метаболической инженерии для производства биотоплива и химикатов из возобновляемой биомассы , что может помочь сократить выбросы парниковых газов». Потенциальное биотопливо включает короткоцепочечные спирты и алканы (для замены бензина ), метиловые эфиры жирных кислот и жирные спирты (для замены дизельного топлива ), а также жирных кислот и изопреноидов биотопливо на основе (для замены дизельного топлива ). ^[10]

Метаболическая инженерия продолжает развиваться в эффективности и процессах, чему способствуют прорывы в области синтетической биологии и прогресс в понимании повреждения метаболитов и его восстановления или предотвращения . Ранние эксперименты по метаболической инженерии показали, что накопление реактивных промежуточных продуктов может ограничивать поток в сконструированных путях и быть вредным для клеток-хозяев, если соответствующие системы контроля повреждений отсутствуют или неадекватны. ^[11]^[12] Исследователи синтетической биологии оптимизируют генетические пути, которые, в свою очередь, влияют на результаты клеточного метаболизма. Недавнее снижение стоимости синтезированной ДНК и развитие генетических цепей помогают повлиять на способность метаболической инженерии давать желаемые результаты. ^[13]

Анализ метаболических потоков

Анализ метаболического потока можно найти в разделе «Анализ баланса потока».

Настройка метаболического пути для анализа

Первым шагом в этом процессе является определение желаемой цели, которую можно достичь путем улучшения или модификации метаболизма организма. Справочники и онлайн-базы данных используются для исследования реакций и метаболических путей, которые способны производить этот продукт или результат. Эти базы данных содержат обширную геномную и химическую информацию, включая пути метаболизма и других клеточных процессов. С помощью этого исследования выбирается организм, который будет использоваться для создания желаемого продукта или результата. Соображения, которые принимаются во внимание при принятии этого решения, заключаются в том, насколько близок метаболический путь организма к желаемому пути, затраты на поддержание, связанные с организмом, и насколько легко изменить путь организма. Escherichia coli ( E. coli ) широко используется в метаболической инженерии для синтеза широкого спектра продуктов, таких как аминокислоты, поскольку ее относительно легко поддерживать и модифицировать. ^[14] Если организм не содержит полного пути получения желаемого продукта или результата, то гены, производящие недостающие ферменты, должны быть включены в организм.

Анализ метаболического пути

Завершенный метаболический путь моделируется математически, чтобы определить теоретический выход продукта или потоки реакции в клетке. Поток — это скорость, с которой происходит данная реакция в сети. Простой анализ метаболических путей можно провести вручную, но в большинстве случаев для выполнения вычислений требуется использование программного обеспечения. ^[15] Эти программы используют сложные алгоритмы линейной алгебры для решения этих моделей. Чтобы решить сеть с использованием уравнения для определенных систем, показанного ниже, необходимо ввести необходимую информацию о соответствующих реакциях и их потоках. Информация о реакции (например, о реагентах и стехиометрии) содержится в матрицах G _x и G _m . Матрицы V _m и V _x содержат потоки соответствующих реакций. После решения уравнение дает значения всех неизвестных потоков (содержащихся в V _x ).

V_{x}=-(G_{x})^{-1}*(G_{m}*V_{m})

Определение оптимальных генетических манипуляций

После решения потоков реакций в сети необходимо определить, какие реакции можно изменить, чтобы максимизировать выход желаемого продукта. Чтобы определить, какие конкретно генетические манипуляции следует выполнить, необходимо использовать вычислительные алгоритмы, такие как OptGene или OptFlux. ^[16] Они дают рекомендации, какие гены следует сверхэкспрессировать, нокаутировать или ввести в клетку, чтобы обеспечить увеличение производства желаемого продукта. Например, если данная реакция имеет особенно низкий поток и ограничивает количество продукта, программное обеспечение может рекомендовать сверхэкспрессировать фермент, катализирующий эту реакцию, в клетке, чтобы увеличить поток реакции. Необходимые генетические манипуляции можно провести с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Гены могут быть сверхэкспрессированы или выведены из организма, в зависимости от их влияния на путь и конечной цели. ^[17]

Экспериментальные измерения

Чтобы создать разрешимую модель, часто необходимо иметь определенные потоки, которые уже известны или измерены экспериментально. Кроме того, чтобы проверить влияние генетических манипуляций на метаболическую сеть (чтобы убедиться, что они соответствуют модели), необходимо экспериментально измерить потоки в сети. Для измерения реакционных потоков измерения потока углерода проводятся с использованием изотопной маркировки углерода-13 . ^[18] Организму подают смесь, содержащую молекулы, в которых определенные атомы углерода представляют собой атомы углерода-13, а не углерода-12. После того, как эти молекулы используются в сети, последующие метаболиты также становятся метками углерода-13, поскольку они включают эти атомы в свои структуры. Конкретный характер маркировки различных метаболитов определяется потоками реакций в сети. Характер мечения можно измерить с помощью таких методов, как газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС), а также вычислительных алгоритмов для определения потоков реакции.

См. также

Ссылки

^ Ян, Ю.Т., Беннет, Дж.Н., Сан, Кентукки, (1998) Генетическая и метаболическая инженерия , Электронный журнал биотехнологии, ISSN 0717-3458
^ Н. Милн, П. Томсен, Н. Мёлгаард Кнудсен, П. Рубашка, М. Кристенсен, Л. Бородина (01.07.2020). «Метаболическая инженерия Saccharomyces cerevisiae для производства de novo псилоцибина и родственных производных триптамина» . Метаболическая инженерия . 60 : 25–36. дои : 10.1016/j.ymben.2019.12.007 . ISSN 1096-7176 . ПМК 7232020 . ПМИД 32224264 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
^ Чжоу, Сюэ-Ронг; Лю, Цин; Сингх, Суриндер (27 марта 2023 г.). «Инженерные пищевые растительные масла, улучшенные» . Ежегодный обзор пищевой науки и технологий . 14 (1): 247–269. doi : 10.1146/annurev-food-052720-104852 . ISSN 1941-1413 .
^ Кулкарни Р., 2016. Метаболическая инженерия: биологическое искусство производства полезных химикатов . Резонанс, 21 (3), 233–237.
^ Вемури, Г.М., Аристиду, А.А., (2005) Метаболическая инженерия в эпоху -омики: объяснение и модуляция регуляторных сетей , Обзор биологии микробов Mol, том. 69:197-216
^ Перейти обратно: ^а ^б Войт, Эберхард, Торрес, Нестор В. (2002). «Анализ путей и оптимизация в метаболической инженерии». Кембридж:University Press, стр.ix-x.
^ Стефанопулос, Г.Н., Аристиду, А.А., Нильсен, Дж. (1998). «Метаболическая инженерия: принципы и методологии». Сан-Диего: Академическая пресса
^ Делломонако, Клементина.(2011). Инженерное обращение цикла бета-окисления для синтеза топлива и химикатов. Природа 476,355-359
^ Патнаик Р. и Ляо Дж. (1994). «Инженерия центрального метаболизма Escherichia coli для производства ароматических метаболитов с выходом, близким к теоретическому». Прил. Окружающая среда. Микробиол. 60(11):3903-3908
^ Кислинг Д., Джей (2010). Передовое производство биотоплива с помощью микробов. Биотехнология.Дж., 5,147-162.
^ Мартин, Винсент Джей-Джей; Питера, Дуглас Дж.; Уизерс, Сиднор Т.; Ньюман, Джек Д.; Кислинг, Джей Д. (1 июля 2003 г.). «Разработка мевалонатного пути в Escherichia coli для производства терпеноидов». Природная биотехнология . 21 (7): 796–802. дои : 10.1038/nbt833 . ISSN 1087-0156 . ПМИД 12778056 . S2CID 17214504 .
^ Уизерс, Сиднор Т.; Готлиб, Шаин С.; Лью, Бонни; Ньюман, Джек Д.; Кислинг, Джей Д. (1 октября 2007 г.). «Идентификация генов биосинтеза изопентенола из Bacillus subtilis методом скрининга, основанным на токсичности предшественников изопреноидов» . Прикладная и экологическая микробиология . 73 (19): 6277–6283. дои : 10.1128/АЕМ.00861-07 . ISSN 0099-2240 . ПМК 2075014 . ПМИД 17693564 .
^ Стефанопулос, Грегори (16 ноября 2012 г.). «Синтетическая биология и метаболическая инженерия». ACS Синтетическая биология . 1 (11): 514–525. дои : 10.1021/sb300094q . ПМИД 23656228 .
^ Калифорнийский университет - Лос-Анджелес (18 декабря 2008 г.). «Генетическая модификация превращает бактерии E. Coli в биотопливо высокой плотности». ScienceDaily. Получено 7 декабря 2011 г. с https://www.sciencedaily.com/releases/2008/12/081218151652.htm .
^ Шелленбергер Дж., Кве Р., Флеминг Р. и др. (2011). «Количественный прогноз клеточного метаболизма с помощью моделей, основанных на ограничениях: COBRA Toolbox v2.0». Протоколы природы. 6(9):1290-1307
^ Роча И., Майя П., Евангелиста П. и др. (2010). «OptFlux: программная платформа с открытым исходным кодом для метаболической инженерии in silico». BMC Сис Биол. 45(4)
^ Уорк, Т.С., Хинтон, Р., Уорк, Э., Доброта, М., Чард, Т. (1980). «Лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии». т.8
^ Вихерт, В. и де Грааф, А.А. (2000). «Стадии двунаправленной реакции в метаболических сетях: моделирование и моделирование экспериментов по мечению изотопов углерода». Биотехнология. Биоинж. 55(1):101-117

Внешние ссылки

Веб-сайт Организации биотехнологической промышленности (BIO):

БИО-сайт

[1] Ян, Ю.Т., Беннет, Дж.Н., Сан, Кентукки, (1998) Генетическая и метаболическая инженерия , Электронный журнал биотехнологии, ISSN 0717-3458

[2] Н. Милн, П. Томсен, Н. Мёлгаард Кнудсен, П. Рубашка, М. Кристенсен, Л. Бородина (01.07.2020). «Метаболическая инженерия Saccharomyces cerevisiae для производства de novo псилоцибина и родственных производных триптамина» . Метаболическая инженерия . 60 : 25–36. дои : 10.1016/j.ymben.2019.12.007 . ISSN 1096-7176 . ПМК 7232020 . ПМИД 32224264 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )

[3] Чжоу, Сюэ-Ронг; Лю, Цин; Сингх, Суриндер (27 марта 2023 г.). «Инженерные пищевые растительные масла, улучшенные» . Ежегодный обзор пищевой науки и технологий . 14 (1): 247–269. doi : 10.1146/annurev-food-052720-104852 . ISSN 1941-1413 .

[4] Кулкарни Р., 2016. Метаболическая инженерия: биологическое искусство производства полезных химикатов . Резонанс, 21 (3), 233–237.

[5] Вемури, Г.М., Аристиду, А.А., (2005) Метаболическая инженерия в эпоху -омики: объяснение и модуляция регуляторных сетей , Обзор биологии микробов Mol, том. 69:197-216

[Voit-6] Перейти обратно: ^а ^б Войт, Эберхард, Торрес, Нестор В. (2002). «Анализ путей и оптимизация в метаболической инженерии». Кембридж:University Press, стр.ix-x.

[7] Стефанопулос, Г.Н., Аристиду, А.А., Нильсен, Дж. (1998). «Метаболическая инженерия: принципы и методологии». Сан-Диего: Академическая пресса

[8] Делломонако, Клементина.(2011). Инженерное обращение цикла бета-окисления для синтеза топлива и химикатов. Природа 476,355-359

[9] Патнаик Р. и Ляо Дж. (1994). «Инженерия центрального метаболизма Escherichia coli для производства ароматических метаболитов с выходом, близким к теоретическому». Прил. Окружающая среда. Микробиол. 60(11):3903-3908

[10] Кислинг Д., Джей (2010). Передовое производство биотоплива с помощью микробов. Биотехнология.Дж., 5,147-162.

[11] Мартин, Винсент Джей-Джей; Питера, Дуглас Дж.; Уизерс, Сиднор Т.; Ньюман, Джек Д.; Кислинг, Джей Д. (1 июля 2003 г.). «Разработка мевалонатного пути в Escherichia coli для производства терпеноидов». Природная биотехнология . 21 (7): 796–802. дои : 10.1038/nbt833 . ISSN 1087-0156 . ПМИД 12778056 . S2CID 17214504 .

[12] Уизерс, Сиднор Т.; Готлиб, Шаин С.; Лью, Бонни; Ньюман, Джек Д.; Кислинг, Джей Д. (1 октября 2007 г.). «Идентификация генов биосинтеза изопентенола из Bacillus subtilis методом скрининга, основанным на токсичности предшественников изопреноидов» . Прикладная и экологическая микробиология . 73 (19): 6277–6283. дои : 10.1128/АЕМ.00861-07 . ISSN 0099-2240 . ПМК 2075014 . ПМИД 17693564 .

[13] Стефанопулос, Грегори (16 ноября 2012 г.). «Синтетическая биология и метаболическая инженерия». ACS Синтетическая биология . 1 (11): 514–525. дои : 10.1021/sb300094q . ПМИД 23656228 .

[14] Калифорнийский университет - Лос-Анджелес (18 декабря 2008 г.). «Генетическая модификация превращает бактерии E. Coli в биотопливо высокой плотности». ScienceDaily. Получено 7 декабря 2011 г. с https://www.sciencedaily.com/releases/2008/12/081218151652.htm .

[15] Шелленбергер Дж., Кве Р., Флеминг Р. и др. (2011). «Количественный прогноз клеточного метаболизма с помощью моделей, основанных на ограничениях: COBRA Toolbox v2.0». Протоколы природы. 6(9):1290-1307

[16] Роча И., Майя П., Евангелиста П. и др. (2010). «OptFlux: программная платформа с открытым исходным кодом для метаболической инженерии in silico». BMC Сис Биол. 45(4)

[17] Уорк, Т.С., Хинтон, Р., Уорк, Э., Доброта, М., Чард, Т. (1980). «Лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии». т.8

[18] Вихерт, В. и де Грааф, А.А. (2000). «Стадии двунаправленной реакции в метаболических сетях: моделирование и моделирование экспериментов по мечению изотопов углерода». Биотехнология. Биоинж. 55(1):101-117

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]