ЛУЧЕНИЕ
В биотехнологии BEAMing , что означает бисер, эмульсия, амплификация, магнетизм, представляет собой высокочувствительный метод цифровой ПЦР , который сочетает в себе эмульсионную ПЦР и проточную цитометрию для выявления и количественной оценки конкретных соматических мутаций, присутствующих в ДНК.
Процесс
[ редактировать ]BEAMing начинается с выделения ДНК из образца крови или плазмы пациента. Целевые области очищенной ДНК подвергаются стадии предварительной амплификации с помощью традиционной ПЦР с использованием праймеров известных последовательностей для амплификации представляющих интерес генетических областей.
Амплифицированные матрицы ДНК затем вводятся в праймеры, которые ковалентно связаны с магнитными шариками посредством взаимодействий стрептавидин - биотин вода в масле , и разделяются на водные микрокапли эмульсии . Водная фаза эмульгируется с маслом, создавая миллионы отдельных капель воды диаметром 3-10 микрон. Внутри каждой капли проводится отдельная реакция ПЦР. Из-за небольшого размера каждая капля воды содержит в среднем одну молекулу ДНК и магнитную частицу. В дополнение к предварительно амплифицированной ДНК каждая капля эмульсии содержит необходимые реагенты и магнитные шарики с направленным праймером для проведения реакции эмульсионной ПЦР. Капли микроэмульсии подвергают температурному циклированию с использованием обычных методов ПЦР. Каждая матрица ДНК (с магнитной частицей, присутствующей в водном отсеке) удлиняется и амплифицируется, в результате чего бусина покрывается тысячами идентичных копий фрагмента ДНК-матрицы.
высокой точности Обычно используется ДНК-полимераза , чтобы ограничить ошибки, обычно возникающие во время ПЦР. Эта мера предосторожности ограничивает риск ложноположительного обнаружения и позволяет точно распознавать целевые молекулы. [1]
После этапа эмульсионной ПЦР водная и масляная фазы разделяются, так что микрочастицы можно собрать в водной фазе. Затем капли микроэмульсии разрушаются, чтобы высвободить магнитные шарики, к которым прикреплены амплифицированные копии ДНК. Гранулы очищают магнитом и флуоресцентные зонды, прикрепляют специфичные для пар оснований. Это помогает различать фрагменты ДНК дикого типа и мутантные, поскольку один флуоресцентный зонд специфически связывается с ДНК дикого типа, а другой — со специфической мутантной ДНК. Каждый флуоресцентно-меченный шарик анализируется в проточном цитометре, что приводит к отделению мутанта от ДНК дикого типа, а также к соотношению мутантной ДНК и ДНК дикого типа, присутствующих в образце.
Микроскопические капли эмульсии, используемые в BEAMing, позволяют разделять сегменты ДНК на отдельные капли. Эмульсионная ПЦР проводится на разделенной на компартменты ДНК, что позволяет проводить параллельно сотни миллионов реакций ПЦР. Эта платформа ПЦР с массовым параллелизмом обеспечивает высокий уровень чувствительности (0,001%) для обнаружения редких молекул опухолевой ДНК среди большого количества ДНК дикого типа. [2] [3]
Приложения
[ редактировать ]BEAMing часто используется в исследованиях рака для проведения оценки циркулирующей опухолевой ДНК ( цДНК ), также известной как жидкая биопсия . [ нужна ссылка ] Это также позволяет количественно оценить мутантную фракцию образца, которую можно отслеживать с течением времени с помощью серийных измерений в плазме. Метод имеет порог чувствительности 0,01%. [4]
История
[ редактировать ]В конце 1990-х годов Фогельштейн и Кинцлер ввели термин « цифровая полимеразная цепная реакция ». [5] при проведении исследований соматических мутаций, связанных с колоректальным раком и потенциально вызывающих его . [2] Фундаментальной проблемой, для решения которой была разработана цифровая ПЦР, было обнаружение незначительных количеств заранее определенной соматической мутации в более крупных популяциях клеток. [6] Хотя как цифровая, так и классическая ПЦР могут использоваться для количественного или качественного анализа, цифровая ПЦР анализирует образцы по одной молекуле за раз, чтобы получить сигнал «все или ничего», тем самым увеличивая соотношение сигнал/шум и общую чувствительность к редким мишеням. [5] Результаты этих исследований показали, что цифровая ПЦР позволила надежно определить относительную долю вариантных последовательностей в образце ДНК. [6]
BEAMing вырос из технологии цифровой ПЦР и в 2003 году был описан в публикации Nature Methods командой Фогельштейна. [7] В 2005 году команда Фогельштейна опубликовала свои первые клинические данные, применяя технологию BEAMing для анализа образцов плазмы пациентов, больных раком. [2] В публикации Nature Medicine 2008 года измерения ктДНК с помощью BEAMing были достаточно чувствительными, чтобы надежно отслеживать динамику опухоли. [8]
В 2008 году была создана компания Inostics GmbH для коммерциализации BEAMing. В 2014 году Inostics была приобретена корпорацией Sysmex и образовала Sysmex Inostics. [9]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Диль, Фрэнк; Смергелиене, Эдита (1 сентября 2013 г.). «BEAMing для рака: обнаружение опухолевых мутаций в периферической крови с помощью цифровой ПЦР» .
- ^ Jump up to: а б с Диль, Фрэнк; Ли, Мэн; Дрессман, Девин; Он, Ипин; Шен, Донг; Сабо, Стив; Диас, Луис А.; Гудман, Стивен Н.; Дэвид, Керстин А. (08 ноября 2005 г.). «Выявление и количественная оценка мутаций в плазме больных колоректальными опухолями» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (45): 16368–16373. Бибкод : 2005PNAS..10216368D . дои : 10.1073/pnas.0507904102 . ISSN 0027-8424 . ПМК 1283450 . ПМИД 16258065 .
- ^ Ли, Мэн; Диль, Фрэнк; Дрессман, Девин; Фогельштейн, Берт; Кинзлер, Кеннет В. (2006). «BEAMing для обнаружения и количественной оценки редких вариантов последовательностей». Природные методы . 3 (2): 95–97. дои : 10.1038/nmeth850 . ПМИД 16432518 . S2CID 13590593 .
- ^ Ван, Джонатан CM; Мэсси, Чарльз; Гарсиа-Корбачо, Хавьер; Мюльер, Флоран; Брентон, Джеймс Д.; Кальдас, Карлос; Пейси, Саймон; Бэрд, Ричард; Розенфельд, Ницан (2017). «Жидкие биопсии достигают зрелости: к внедрению циркулирующей опухолевой ДНК» . Обзоры природы Рак . 17 (4): 223–238. дои : 10.1038/nrc.2017.7 . ПМИД 28233803 . S2CID 4561229 .
- ^ Jump up to: а б Морли, Александр А. (2014). «Цифровая ПЦР: Краткая история» . Биомолекулярное обнаружение и количественный анализ . 1 (1): 1–2. дои : 10.1016/j.bdq.2014.06.001 . ПМК 5129430 . ПМИД 27920991 .
- ^ Jump up to: а б Фогельштейн, Берт; Кинзлер, Кеннет В. (3 августа 1999 г.). «Цифровая ПЦР» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 96 (16): 9236–9241. Бибкод : 1999PNAS...96.9236V . дои : 10.1073/pnas.96.16.9236 . ISSN 0027-8424 . ЧВК 17763 . ПМИД 10430926 .
- ^ Дрессман, Девин; Ян, Хай; Траверсо, Джованни; Кинзлер, Кеннет В.; Фогельштейн, Берт (22 июля 2003 г.). «Преобразование отдельных молекул ДНК во флуоресцентные магнитные частицы для обнаружения и подсчета генетических вариаций» . Труды Национальной академии наук . 100 (15): 8817–8822. Бибкод : 2003PNAS..100.8817D . дои : 10.1073/pnas.1133470100 . ISSN 0027-8424 . ПМК 166396 . ПМИД 12857956 .
- ^ Диль, Фрэнк; Шмидт, Керстин; Чоти, Майкл А; Римляне, Кэтрин; Гудман, Стивен; Ли, Мэн; Торнтон, Кэтрин; Агравал, Нишант; Соколл, Лори (2008). «Циркулирующая мутантная ДНК для оценки динамики опухоли» . Природная медицина . 14 (9): 985–990. дои : 10.1038/нм.1789 . ПМК 2820391 . ПМИД 18670422 .
- ^ «ОБНОВЛЕНИЕ: японская компания Sysmex приобретает немецкую компанию Inostics, Partec» . ГеномВеб . Проверено 17 октября 2017 г.