Анализ кривой плавления
Анализ кривой плавления представляет собой оценку характеристик диссоциации двухцепочечной ДНК при нагревании. При повышении температуры двойная цепь начинает диссоциировать, что приводит к увеличению интенсивности поглощения, гиперхромности . Температура, при которой денатурируется 50% ДНК, называется температурой плавления . Измерение температуры плавления может помочь нам предсказать виды, просто изучая температуру плавления. Это связано с тем, что каждый организм имеет определенную кривую плавления.
Собранная информация может быть использована для вывода о наличии и идентичности однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Это связано с тем, что пары оснований GC имеют между собой 3 водородные связи , а пары оснований AT имеют только 2. ДНК с мутациями от A или T до C или G создаст более высокую температуру плавления.
Эта информация также дает важные подсказки о способе взаимодействия молекулы с ДНК. Молекулы, такие как интеркаляторы, располагаются между парами оснований и взаимодействуют посредством укладки пи . Это оказывает стабилизирующее воздействие на структуру ДНК, что приводит к повышению температуры ее плавления. Аналогично, увеличение концентрации соли помогает рассеивать отрицательное отталкивание между фосфатами в остове ДНК. Это также приводит к повышению температуры плавления ДНК. И наоборот, pH может оказывать негативное влияние на стабильность ДНК, что может привести к снижению температуры ее плавления.
Выполнение
[ редактировать ]
Энергия, необходимая для разрыва водородной связи между двумя цепями ДНК, зависит от их длины, содержания GC и их комплементарности. Эти свойства можно определить, нагревая реакционную смесь, содержащую двухцепочечные последовательности ДНК, и измеряя диссоциацию в зависимости от температуры.
Первоначально диссоциацию нитей наблюдали с помощью измерений поглощения УФ-излучения. [1] но методы, основанные на измерениях флуоресценции [2] в настоящее время являются наиболее распространенным подходом.
Зависимую от температуры диссоциацию между двумя цепями ДНК можно измерить с помощью интеркалирующего ДНК флуорофора , такого как SYBR green , EvaGreen, или меченных флуорофором ДНК-зондов . В случае зеленого SYBR (который флуоресцирует в 1000 раз интенсивнее при интеркалировании в малую бороздку двух нитей ДНК) диссоциацию ДНК при нагревании можно измерить по значительному снижению флуоресценции, которое в результате этого происходит. [3] расположенные рядом зонды (один с флуорофором, а другой с подходящим тушителем ). Альтернативно, для определения комплементарности зонда целевой последовательности можно использовать [3]
График отрицательной первой производной кривой плавления может облегчить точное определение температуры диссоциации (определяемой как 50% диссоциация) благодаря образующимся таким образом пикам.
SYBR Green позволил дифференцировать продукт с помощью LightCycler в 1997 году. [4] Также было продемонстрировано, что зонды гибридизации (или зонды FRET) обеспечивают очень специфические кривые плавления одноцепочечного (ss) гибрида зонд-ампликон. Idaho Technology и Roche многое сделали для популяризации использования прибора LightCycler.
Приложения
[ редактировать ]С конца 1990-х годов анализ продукта с помощью SYBR Green, других двухцепочечных специфических красителей или анализ кривой плавления на основе зонда стал почти повсеместным. Методика на основе зондов достаточно чувствительна для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и позволяет различать гомозиготные аллели дикого типа , гетерозиготные и гомозиготные мутантные аллели на основании полученных паттернов диссоциации. Без зондов плавление ампликона (плавление и анализ всего ПЦР-продукта) обычно не было успешным при обнаружении вариантов одного основания по профилям плавления. Благодаря инструментам с более высоким разрешением и современным красителям анализ плавления ампликонов одного варианта основания теперь возможен с помощью нескольких коммерчески доступных инструментов. Например: быстрая система Applied Biosystems 7500 и быстрая система ПЦР в реальном времени 7900HT, LightScanner от Idaho Technology (первое пластинчатое плавильное устройство с высоким разрешением), инструменты Rotor-Gene от Qiagen и инструменты LightCycler 480 от Roche.
Множество исследований и клинических примеров [5] В литературе существуют данные, показывающие использование анализа кривой плавления, чтобы избежать или дополнить усилия по секвенированию и, таким образом, снизить затраты.
Хотя большинство машин для количественной ПЦР имеют возможность построения и анализа кривой плавления, уровень анализа и программного обеспечения варьируется. Плавление высокого разрешения (известное как плавление Hi-Res или HRM) является развитием этой общей технологии и начало обеспечивать более высокую чувствительность для обнаружения SNP в пределах всего окрашенного красителем ампликона. Разработка беззондовых систем кривой плавления обходится дешевле и проще по конструкции. Однако для приложений генотипирования, где необходимо обрабатывать большие объемы образцов, стоимость разработки может быть менее важной, чем общая производительность и простота интерпретации, что отдает предпочтение методам генотипирования на основе зондов.
Цифровая плавка высокого разрешения (dHRM) [6] также используется в сочетании с цифровой ПЦР (дПЦР) для повышения количественной мощности за счет предоставления дополнительной информации о поведении плавления амплифицированной ДНК, что может помочь различить различные генетические варианты и обеспечить точность количественного определения. [7] dHRM обеспечивается за счет использования чувствительных ДНК-связывающих красителей и цифрового оборудования для ПЦР, которое позволяет собирать точки данных с высокой плотностью для создания подробных профилей плавления. Эти профили можно использовать для выявления даже незначительных различий в последовательностях нуклеиновых кислот, что делает dHRM мощным инструментом для генотипирования, сканирования мутаций и анализа метилирования. [8]
dHRM — это передовой молекулярный метод, используемый для анализа генетических вариаций, таких как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), мутации и метилирования, путем мониторинга поведения плавления двухцепочечной ДНК. [9] Это пост-ПЦР-метод, который включает постепенное нагревание ПЦР-амплифицированной ДНК в присутствии интеркалирующих красителей, которые флуоресцируют при связывании с двухцепочечной ДНК. По мере плавления ДНК флуоресценция уменьшается, а изменения флуоресценции отслеживаются в режиме реального времени с помощью цифровой системы ПЦР. Полученные кривые плавления затем анализируются для выявления генетических различий на основе температур плавления фрагментов ДНК.
Этот метод получил дальнейшее развитие благодаря его применению на платформах цифровой микрофлюидики, которые могут облегчить анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) с высокой точностью и чувствительностью. [10] Кроме того, была разработана массово-параллельная программа dHRM, обеспечивающая быстрое и абсолютно количественное профилирование последовательностей, что может быть особенно полезно в клинических и промышленных условиях, где точное количественное определение нуклеиновых кислот имеет решающее значение. [11]
См. также
[ редактировать ]- Анализ расплава с высоким разрешением
- Микромасштабный термофорез — метод определения стабильности, длины, конформации и модификаций ДНК и РНК. [12]
- Термодинамика нуклеиновых кислот
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Ансевин, АТ; Визард, ДЛ; Браун, BW; МакКонати, Дж. (1976), «Термическая денатурация ДНК с высоким разрешением. I. Теоретические и практические соображения по разрешению тепловых субпереходов», Biopolymers , 15 (1): 153–74, doi : 10.1002/bip.1976.360150111 , PMID 1244898
- ^ Рири, КМ; Расмуссен, РП; Виттвер, Коннектикут (1997), "Дифференциация продуктов путем анализа кривых плавления ДНК во время полимеразной цепной реакции", Anal. Биохим. , 245 (2): 154–60, doi : 10.1006/abio.1996.9916 , PMID 9056205
- ^ Jump up to: а б Хоу, Шоу (2010). Биокатализ и биомолекулярная инженерия . Джон Уайли и сыновья. стр. 314–317.
- ^ Рири, 1997
- ^ Лэй MJ, Виттвер, Коннектикут. (1997)Флуоресцентное генотипирование фактора V Лейдена в реальном времени во время ПЦР с быстрым циклом. Клин Чем. 1997 декабрь;43(12):2262-7
- ^ «Универсальное цифровое плавление высокого разрешения: новый подход к широкому профилированию гетерогенных биологических образцов» . Academic.oup.com . Проверено 15 февраля 2024 г.
- ^ Аралар, апрель; Юань, Исюй; Чен, Кевин; Гэн, Юншу; Ортис Велес, Дэниел; Синха, Мриду; Лоуренс, Шелли М.; Фрейли, Стефани И. (26 мая 2020 г.). «Повышение количественной мощности цифровой ПЦР посредством цифрового плавления с высоким разрешением» . Журнал клинической микробиологии . 58 (6): e00325–20. дои : 10.1128/JCM.00325-20 . ISSN 1098-660X . ПМЦ 7269394 . ПМИД 32295887 .
- ^ «Что такое плавление высокого разрешения (HRM)? | Bio-Rad» . www.bio-rad.com (на корейском языке) . Проверено 15 февраля 2024 г.
- ^ «Введение в плавление с высоким разрешением (также известное как HRM, HRMA, анализ кривой плавления)» . dna-utah.org . Проверено 15 февраля 2024 г.
- ^ Ли, Минчжун; Ван, Лян; Ло, Ман-Кей; Мэн, Ли; Цзя, Янвэй; Мак, Пуй-Ин; Мартинс, Руй П. (01 февраля 2022 г.). «Однократный анализ кривой плавления с высоким разрешением для распознавания точечных мутаций KRAS на платформе цифровой микрофлюидики» . Лаборатория на чипе . 22 (3): 537–549. дои : 10.1039/D1LC00564B . ISSN 1473-0189 .
- ^ Велес, Дэниел Ортис; Мак, Ханна; Юп, Джульетта; Хокер, Шинейд; Кулкарни, Нинад; Хедаятния, Бехнам; Чжан, Ян; Лоуренс, Шелли; Фрейли, Стефани И. (08 февраля 2017 г.). «Массивно-параллельная цифровая плавка с высоким разрешением для быстрого и абсолютно количественного профилирования последовательностей» . Научные отчеты . 7 (1): 42326. дои : 10.1038/srep42326 . ISSN 2045-2322 . ПМК 5296755 .
- ^ Винкен К.Дж., Бааске П., Дур С., Браун Д. (2011), «Кривые термофоретического плавления количественно определяют конформацию и стабильность РНК и ДНК», Nucleic Acids Research , 39 (8): e52–e52, doi : 10.1093/nar/gkr035 , PMC 3082908 , PMID 21297115 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Рири, КМ; Расмуссен, РП; Виттвер, Коннектикут (1997). «Дифференциация продуктов путем анализа кривых плавления ДНК в ходе полимеразной цепной реакции». Анальная биохимия . 245 (2): 154–160. дои : 10.1006/abio.1996.9916 . ПМИД 9056205 .
- Ло, Патчик CH (21 октября 2014 г.). «Моменты: анализ кривой плавления» . БиоТехники . Проверено 21 октября 2014 г.