Анионообменная хроматография
| Акроним | HPAE [1] |
|---|---|
| Классификация | Ионообменная хроматография Колоночная хроматография |
| Другие методы | |
| Связанный | Хроматография Высокоэффективная жидкостная хроматография Водная нормально-фазовая хроматография Эксклюзионная хроматография по размеру Мицеллярная жидкостная хроматография |
Анионообменная хроматография — это процесс разделения веществ в зависимости от их заряда с использованием ионообменной смолы , содержащей положительно заряженные группы, такие как диэтиламиноэтильные группы (DEAE). [2] В растворе смола покрыта положительно заряженными противоионами ( катионами ). Анионообменные смолы связываются с отрицательно заряженными молекулами, вытесняя противоион. Анионообменная хроматография обычно используется для очистки белков , аминокислот , сахаров / углеводов и других кислых веществ. [3] с отрицательным зарядом при более высоких уровнях pH . Плотность связи вещества со смолой основана на силе отрицательного заряда вещества.
Общая методика очистки белков
[ редактировать ]В колонку заливают суспензию смолы, такой как DEAE-Sephadex. Используемая матрица нерастворима с ковалентно связанными заряженными группами. Эти заряженные группы называются обменниками, такими как катионообменники и анионообменники. После отстаивания колонку предварительно уравновешивают в буфере перед нанесением белковой смеси. DEAE-Сефадекс представляет собой положительно заряженную суспензию, которая будет иметь электростатические взаимодействия с отрицательно заряженными атомами, заставляя их элюироваться позже, чем положительно заряженные молекулы в интересующем образце. Это метод разделения, широко используемый для обнаружения определенных белков или ферментов в организме. [2] Несвязанные белки собираются в проточном режиме и/или в последующих промывках буфером. Белки, которые связываются с положительно заряженной смолой, сохраняются и могут быть элюированы одним из двух способов. Сначала постепенно увеличивают концентрацию соли в элюирующем буфере. Отрицательные ионы в солевом растворе (например, Cl − ) конкурируют с белком за связывание со смолой. Во-вторых, pH раствора можно постепенно снижать, что приводит к более положительному заряду белка, высвобождающему его из смолы. Оба эти метода могут вытеснить отрицательно заряженный белок, который затем элюируется во фракции пробирок с буфером. [4] [5] [6]
Разделение белков будет зависеть от различий в общем заряде. Состав ионизируемых групп боковой цепи будет определять общий заряд белка при определенном pH . В изоэлектрической точке (pI) общий заряд белка равен 0, и он не связывается с матрицей. Если pH выше pI, белок будет иметь отрицательный заряд и связываться с матрицей в анионообменной колонке. Стабильность белка при значениях выше или ниже pI будет определять, следует ли использовать анионообменную или катионообменную колонку. Если он стабилен при значениях pH ниже pI, следует использовать катионообменную колонку. Если он стабилен при значениях pH выше pI, можно использовать анионообменную колонку. [7]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Ли, Ю.К. (1990). «Высокоэффективная анионообменная хроматография для анализа углеводов» . Аналитическая биохимия . 189 (2): 151–62. дои : 10.1016/0003-2697(90)90099-у . ПМИД 2281856 .
- ^ Jump up to: а б Фоцис Т., Х. Адлеркройц; Ярвенпяя, Паула; Сетчелл, КДР; Аксельсон, М.; Шёвалл, Дж. (1981). «Групповое разделение стероидных конъюгатов с помощью анионообменной хроматографии DEAE-сефадекс». Журнал биохимии стероидов . 14 (5): 457–63. дои : 10.1016/0022-4731(81)90357-5 . ПМИД 7300338 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Роклин, Рой Д.; Пол, Кристофер А. (1983). «Определение углеводов методом анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием». Журнал жидкостной хроматографии . 6 (9): 1577–590. дои : 10.1080/01483918308064876 .
- ^ Дуонг-Ли, Кришна К.; Габелли, Сандра Б. (2014). «Использование ионообменной хроматографии для очистки рекомбинантно экспрессированного белка». Лабораторные методы в энзимологии: Белок, часть C. Том. 541. Академик Пресс. стр. 95–103. дои : 10.1016/b978-0-12-420119-4.00008-2 . ISBN 9780124201194 . ПМИД 24674065 .
- ^ «Ионный обмен FPLC и хроматофокусирование: принципы и методы». Фармация Биотех . Фармация Биотех АБ. 1985.
- ^ Руководство по ионообменной хроматографии . Гарвардский аппарат. п. 2.
- ^ Руководство по ионообменной хроматографии . Гарвардский аппарат. п. 3.