ChiRP-Seq

ChiRP-Seq (выделение хроматина путем очистки РНК ) — это высокопроизводительный метод секвенирования для обнаружения областей генома , которые связаны специфической РНК (или рибонуклеопротеином, содержащим интересующую РНК). Недавние исследования показали, что значительная часть некоторых геномов (включая геномы мыши и человека) синтезирует РНК, которые, по-видимому, не кодируют белки. Функция большинства этих некодирующих РНК еще предстоит выяснить. Разрабатываются различные геномные методы для картирования функциональной ассоциации этих новых РНК с отдельными участками генома, чтобы лучше понять их функцию. ChiRP-Seq — один из этих новых методов, который использует возможности массового параллельного секвенирования секвенаторов 2-го поколения для каталогизации сайтов связывания этих новых молекул РНК в геноме.

Хотя многие считали, что РНК в основном кодируют белки, очень большая часть генома эукариот состоит из РНК, которые этого не делают. Первоначально эти РНК считались мусором, пока новые достижения не привели к осознанию того, что они действительно могут иметь биологическое назначение. За последние несколько лет днРНК были наименее изученными и функционально охарактеризованными появляющимися регуляторными молекулами, особенно по сравнению с их короткими аналогами, малыми нкРНК. ^{[ 1 ]} ChiRP-Seq — это новый метод, который позволил нам картировать заселенность длинных РНК по всему геному с более высоким разрешением, чем когда-либо прежде. ChiRP-Seq работает посредством аффинного захвата целевого комплекса днРНК и хроматина путем укладки антисмысловых олигонуклеотидов. ^{[ 2 ]} Этот метод позволит ученым очень точно создать карту геномных сайтов связывания из нескольких сотен оснований благодаря высокой чувствительности и низкому фону.

Обзор метода

Десятки олигонуклеотидных зондов созданы так, чтобы они были комплементарны интересующей РНК. Эти олигонуклеотиды мечены биотином . Клетки сшивают УФ-излучением или формалином и из этих обработанных клеток выделяют ядра. Выделенные ядра лизировали, а высвободившийся хроматин фрагментировали ультразвуком с получением фрагментов размером приблизительно 100-500 п.н. Эти фрагменты хроматина гибридизовали с набором биотинилированных зондов. Комплексы, содержащие биотин-зонд + представляющая интерес РНК + фрагмент ДНК, захватываются магнитными шариками, меченными стрептавидином .

ДНК выделяют из аликвоты связанного комплекса путем обработки РНКазой (или протеиназой с последующей РНКазой) для расщепления ассоциированного белка и РНК. РНК также можно выделить из дополнительной аликвоты связанного комплекса для обнаружения других молекул РНК, связанных с интересующей РНК. Очищенную ДНК затем используют для подготовки библиотеки секвенирования, и библиотеку секвенируют в системе секвенирования ДНК нового поколения. Затем результаты секвенирования сопоставляются с геномом. Скопление чтений в определенных местах генома указывает на то, что интересующая РНК связалась с этой областью генома. Это помогает определить конкретные области генома, которые взаимодействуют с РНК. Например, геномные мишени энхансерной РНК, действующие на расстоянии от места их синтеза, можно легко оценить с помощью ChiRP-Seq. ^{[ 3 ]}^{[ 4 ]}

Ссылки

^ Чу, Куинн, Дж., и Чанг, HY (2012). Выделение хроматина методом очистки РНК (ChIRP). Журнал визуализированных экспериментов, 61. https://doi.org/10.3791/3912 .
^ Джатхар, Кумар, В., Шривастава, Дж., и Трипати, В. (2017). Технологические разработки в биологии днРНК. Биология длинных некодирующих РНК, 283–323. https://doi.org/10.1007/978-981-10-5203-3_10
^ Чу, Ци; Цюй, Кун; Чжун, Франклин Л.; Артанди, Стивен Э.; Чанг, Ховард Ю. (31 августа 2011 г.). «Геномные карты занятости длинных некодирующих РНК раскрывают принципы взаимодействия РНК-хроматина» . Молекулярная клетка . 44 (4): 667–678. doi : 10.1016/j.molcel.2011.08.027 . ПМК 3249421 . ПМИД 21963238 .
^ Ли, В.; Нотани, Д.; Ма, Кью; Танаса, Б.; Нуньес, Э.; и др. (2013). «Функциональная роль энхансерных РНК в эстроген-зависимой активации транскрипции» . Природа . 498 (7455): 516–520. Бибкод : 2013Natur.498..516L . дои : 10.1038/nature12210 . ПМЦ 3718886 . ПМИД 23728302 .

[1] Чу, Куинн, Дж., и Чанг, HY (2012). Выделение хроматина методом очистки РНК (ChIRP). Журнал визуализированных экспериментов, 61. https://doi.org/10.3791/3912 .

[2] Джатхар, Кумар, В., Шривастава, Дж., и Трипати, В. (2017). Технологические разработки в биологии днРНК. Биология длинных некодирующих РНК, 283–323. https://doi.org/10.1007/978-981-10-5203-3_10

[3] Чу, Ци; Цюй, Кун; Чжун, Франклин Л.; Артанди, Стивен Э.; Чанг, Ховард Ю. (31 августа 2011 г.). «Геномные карты занятости длинных некодирующих РНК раскрывают принципы взаимодействия РНК-хроматина» . Молекулярная клетка . 44 (4): 667–678. doi : 10.1016/j.molcel.2011.08.027 . ПМК 3249421 . ПМИД 21963238 .

[4] Ли, В.; Нотани, Д.; Ма, Кью; Танаса, Б.; Нуньес, Э.; и др. (2013). «Функциональная роль энхансерных РНК в эстроген-зависимой активации транскрипции» . Природа . 498 (7455): 516–520. Бибкод : 2013Natur.498..516L . дои : 10.1038/nature12210 . ПМЦ 3718886 . ПМИД 23728302 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]