ДНК-полимераза Φ29

ДНК-полимераза
Идентификаторы
Организм	Фаг бациллы phi29
Символ	2
ЮниПрот	P03680
показывать Искать Structures Swiss-model Domains InterPro

ДНК-полимераза типа B, органелларная и вирусная, phi29-подобная
Идентификаторы
Символ	DNA_pol_B_2
Пфам	PF03175
ИнтерПро	ИПР014416
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ 2	2py5 / SCOPe / СУПФАМ
показывать Доступные белковые структуры: Pfam   structures / ECOD   PDB RCSB PDB; PDBe; PDBj PDBsum structure summary

ДНК-полимераза Ф29 представляет собой фермент бактериофага Ф29 . Он все чаще используется в молекулярной биологии для процедур амплификации ДНК с множественным замещением и имеет ряд особенностей, которые делают его особенно подходящим для этого применения. Его открыли и охарактеризовали испанские учёные Луис Бланко и Маргарита Салас .

Репликация ДНК Φ29

Φ29 представляет собой бактериофаг Bacillus subtilis с секвенированным линейным геномом ДНК из 19 285 пар оснований. Каждый 5'-конец ковалентно связан с концевым белком, который играет важную роль в процессе репликации, действуя как праймер для вирусной ДНК-полимеразы. Был предложен симметричный способ репликации, при котором инициация с белком происходит неодновременно с любого конца хромосомы; это включает два начала репликации и два различных мономера полимеразы. Синтез является непрерывным и включает механизм смещения нитей. Это было продемонстрировано способностью фермента продолжать копировать однопримированный кольцевой геном фага М13 более чем в десять раз в одной цепи (более 70 т.п.н. в одной цепи). Эксперименты in vitro показали, что репликация Φ29 может продолжаться до завершения при наличии потребности в единственном фаговом белке - полимеразе и терминальном белке. Полимераза катализирует образование инициирующего комплекса между концевым белком и концами хромосомы на адениновом остатке. Отсюда может происходить непрерывный синтез.

Полимераза

Полимераза представляет собой мономерный белок с двумя различными функциональными доменами. Эксперименты по сайт-направленному мутагенезу подтверждают предположение о том, что этот белок демонстрирует структурное и функциональное сходство с фрагментом Кленова фермента Escherichia coli ; полимеразы I он включает С-концевой полимеразный домен и пространственно разделенный N-концевой домен с 3'-5'- экзонуклеазной активностью.

Выделенный фермент не обладает собственной геликазной активностью, но может выполнять эквивалентную функцию за счет прочного связывания с одноцепочечной ДНК , особенно предпочтительно с двухцепочечной нуклеиновой кислотой. Это свойство этого фермента делает его пригодным для множественной амплификации смещения . Фермент облегчает «разветвление» двухцепочечной ДНК. Расщепление дезоксирибонуклеозидтрифосфата , которое происходит как часть процесса полимеризации, вероятно, обеспечивает энергию, необходимую для этого механизма раскручивания. Непрерывный характер синтеза цепей (по сравнению с асимметричным синтезом, наблюдаемым у других организмов), вероятно, способствует этой повышенной процессивности. Корректирующая активность, обеспечиваемая экзонуклеазным доменом, была продемонстрирована путем демонстрации преимущественного удаления несовпадающего нуклеотида с 3'-конца вновь синтезированной цепи. Экзонуклеазная активность фермента, как и его полимеризационная активность, является высокопроцессивной и может разрушать одноцепочечные олигонуклеотиды без диссоциации. Сотрудничество или «тонкая конкуренция» между этими двумя функциональными доменами имеет важное значение для обеспечения точного удлинения с оптимальной скоростью. Экзонуклеазная активность фермента препятствует его способности к полимеризации; инактивация экзонуклеазной активности посредством сайт-направленного мутагенеза означала, что для достижения тех же скоростей удлинения праймера, что и у фермента дикого типа , требовалась концентрация dNTP в 350 раз меньшая .

Полногеномная амплификация

Фермент-полимераза Φ29 уже используется в процедурах множественной амплификации смещения (MDA) (в том числе в ряде коммерческих наборов), посредством чего фрагменты длиной в десятки тысяч оснований могут быть получены из неспецифических гексамерных праймеров, отжигаемых через определенные интервалы по геному. Фермент обладает множеством полезных свойств, которые делают его пригодным для полногеномной амплификации (WGA) этим методом.

• Высокая процессивность.
• Корректёрская деятельность. Считается, что она на 1–2 порядка менее подвержена ошибкам, чем Taq-полимераза.
• Генерирует большие фрагменты, более 10кб.
• Производит больше ДНК, чем методы, основанные на ПЦР, примерно на порядок.
• Требуется минимальное количество шаблонов; 10 нг достаточно.
• Новый механизм репликации; амплификация с многоцепочечным смещением.
  • случайные праймеры (гексамеры), нет необходимости разрабатывать конкретные праймеры/нацеливаться на определенные области. Можно использовать
  • Нет необходимости в термоциклировании.
• Хороший охват и меньшая погрешность амплификации по сравнению с подходами на основе ПЦР. Есть предположение, что это наименее предвзятый из используемых методов WGA.

Дальнейшее чтение

• Линк Л., Реш-Генгер Ю (2010). «Идентификация эффективных флуорофоров для прямого мечения ДНК с помощью полимеразы φ29 амплификации по катящемуся кругу (RCA)». Eur J Med Chem . 45 (12): 5561–6. дои : 10.1016/j.ejmech.2010.09.005 . ПМИД   20926164 .
• де Вега М., Ласаро Х.М., Менсия М., Бланко Л., Салас М. (2010). «Улучшение эффективности амплификации ДНК-полимеразы φ29 за счет слияния мотивов связывания ДНК» . Proc Natl Acad Sci США . 107 (38): 16506–11. Бибкод : 2010PNAS..10716506D . дои : 10.1073/pnas.1011428107 . ПМЦ   2944734 . ПМИД   20823261 .
• Перес-Арнаис П., Ласаро Х.М., Салас М., де Вега М. (2010). «Активный сайт ДНК-полимеразы phi29: роль остатка Val250 в качестве лиганда комплекса металл-dNTP и в инициации инициации белка». Дж Мол Биол . 395 (2): 223–33. дои : 10.1016/j.jmb.2009.10.061 . hdl : 10486/709525 . ПМИД   19883660 .
• Перес-Арнаис П., Ласаро Х.М., Салас М., де Вега М. (2009). «Функциональное значение остатка ДНК-полимеразы бактериофага phi29 Tyr148 в стабилизации праймер-конца в активном сайте 3'-5' экзонуклеазы». Дж Мол Биол . 391 (5): 797–807. дои : 10.1016/j.jmb.2009.06.068 . hdl : 10486/709542 . ПМИД   19576228 .
• Джон Р., Мюллер Х., ректор А., ван Ранст М., Стивенс Х. (2009). «Амплификация вирусных ДНК-геномов по принципу катящегося круга с использованием полимеразы phi29». Тенденции Микробиол . 17 (5): 205–11. дои : 10.1016/j.tim.2009.02.004 . ПМИД   19375325 .
• Лагунавичюс А, Меркене Е, Киверите З, Саванявичюте А, Зимбайте-Рускулиене В, Радзвилавичюс Т, Янулайтис А (2009). «Новое применение ДНК-полимеразы Phi29: обнаружение и анализ РНК in vitro и in situ с помощью RCA, примированного целевой РНК» . РНК . 15 (5): 765–71. дои : 10.1261/rna.1279909 . ПМК   2673074 . ПМИД   19244362 .
• Родригес I, Ласаро Х.М., Салас М., де Вега М. (2009). «Участие движения субдомена TPR2 в деятельности ДНК-полимеразы phi29» . Нуклеиновые кислоты Рез . 37 (1): 193–203. дои : 10.1093/нар/gkn928 . ПМК   2615600 . ПМИД   19033368 .
• Саху С., ЛаБин Т.Х., Рейф Дж.Х. (2008). «Устройство нанотранспорта ДНК, работающее на основе полимеразы phi29». Нано Летт . 8 (11): 3870–8. CiteSeerX   10.1.1.151.6316 . дои : 10.1021/nl802294d . ПМИД   18939810 .
• Сюй Ю, Гао С., Бруно Дж.Ф., Люфт Б.Дж., Данн Дж.Дж. (2008). «Быстрое обнаружение и идентификация ДНК возбудителя с использованием ДНК-полимеразы Phi29» . Биохим. Биофиз. Рез. Коммун . 375 (4): 522–5. дои : 10.1016/j.bbrc.2008.08.082 . ПМК   2900840 . ПМИД   18755142 .
• Кумар Г., Гарнова Е., Рейгин М., Видали А. (2008). «Улучшенная амплификация с множественным смещением с помощью ДНК-полимеразы phi29 для генотипирования отдельных клеток человека» . БиоТехники . 44 (7): 879–90. дои : 10.2144/000112755 . ПМИД   18533898 .
• Салас М., Бланко Л., Лазаро Х.М., де Вега М. (2008). «ДНК-полимераза бактериофага phi29» . ИУБМБ Жизнь . 60 (1): 82–5. дои : 10.1002/iub.19 . ПМИД   18379997 . S2CID   39622915 .
• Силандер К., Саарела Дж. (2008). «Амплификация всего генома с помощью ДНК-полимеразы Phi29 для обеспечения генетического или геномного анализа образцов с низким выходом ДНК». Протоколы геномики . Методы молекулярной биологии. Том. 439. стр. 1–18. дои : 10.1007/978-1-59745-188-8_1 . ISBN  978-1-58829-871-3 . ПМИД   18370092 .
• Лагунавичюс А, Киверите З, Зимбайте-Рускулиене В, Радзвилавичюс Т, Янулайтис А (2008). «Двойственность полинуклеотидных субстратов ДНК-полимеразы Phi29: 3'-->5'-РНКазная активность фермента» . РНК . 14 (3): 503–13. дои : 10.1261/rna.622108 . ПМК   2248250 . ПМИД   18230765 .
• Перес-Арнаис П., Лонгас Э., Вильяр Л., Ласаро Х.М., Салас М., де Вега М. (2007). «Участие ДНК-полимеразы фага phi29 и концевых белковых субдоменов в обеспечении специфичности во время инициации репликации ДНК с белком» . Нуклеиновые кислоты Рез . 35 (21): 7061–73. дои : 10.1093/nar/gkm749 . ПМК   2175359 . ПМИД   17913744 .
• Берман А.Дж., Камтекар С., Гудман Дж.Л., Лазаро Х.М., де Вега М., Бланко Л., Салас М., Стейц Т.А. (2007). «Структуры ДНК-полимеразы phi29 в комплексе с субстратом: механизм транслокации в полимеразах B-семейства» . ЭМБО Дж . 26 (14): 3494–505. дои : 10.1038/sj.emboj.7601780 . ЧВК   1933411 . ПМИД   17611604 .
• Книерим Д., Майсс Э. (2007). «Применение ДНК-полимеразы Phi29 для идентификации и инокуляции полноразмерных клонов тайского вируса скручиваемости листьев томата и таиландского вируса курчавости листьев табака». Арх Вирол . 152 (5): 941–54. дои : 10.1007/s00705-006-0914-9 . ПМИД   17226067 . S2CID   12464800 .
• Овор Б.Е., Шепард Д.Н., Тейлор Н.Дж., Эдема Р., Монджан А.Л., Томсон Дж.А., Мартин Д.П., Варсани А. (2007). «Успешное применение технологии FTA Classic Card и использование ДНК-полимеразы бактериофага phi29 для крупномасштабного отбора проб в полевых условиях и клонирования полных геномов вируса полосатости кукурузы». Дж. Вироловые методы . 140 (1–2): 100–5. дои : 10.1016/j.jviromet.2006.11.004 . ПМИД   17174409 .
• Сато М., Оцука М., Оми Ю. (2004). «Повторная GenomiPhi, амплификация по катящемуся кругу на основе ДНК-полимеразы phi29, полезна для получения больших количеств плазмидной ДНК» . Нуклеиновые кислоты Symp Ser (Oxf) . 48 (48): 147–8. дои : 10.1093/насс/48.1.147 . ПМИД   17150521 .
• Перес-Арнаис П., Ласаро Х.М., Салас М., де Вега М. (2006). «Участие субдомена большого пальца ДНК-полимеразы phi29 в правильной координации синтеза и деградации во время репликации ДНК» . Нуклеиновые кислоты Рез . 34 (10): 3107–15. дои : 10.1093/нар/gkl402 . ПМЦ   1475753 . ПМИД   16757576 .
• Камтекар С., Берман А.Дж., Ван Дж., Лазаро Х.М., де Вега М., Бланко Л., Салас М., Стейц Т.А. (2006). «Структура ДНК-полимераза phi29: белок-праймер предлагает модель инициирования перехода к элонгации» . ЭМБО Дж . 25 (6): 1335–43. дои : 10.1038/sj.emboj.7601027 . ПМЦ   1422159 . ПМИД   16511564 .
• Хатчисон К.А., Смит Х.О., Пфанкох С., Вентер Дж.К. (2005). «Бесклеточное клонирование с использованием ДНК-полимеразы phi29» . Proc Natl Acad Sci США . 102 (48): 17332–6. Бибкод : 2005PNAS..10217332H . дои : 10.1073/pnas.0508809102 . ПМЦ   1283157 . ПМИД   16286637 .
• Сато М., Оцука М., Оми Ю. (2005). «Полезность повторного GenomiPhi, набора для амплификации катящегося круга на основе ДНК-полимеразы phi29, для получения больших количеств плазмидной ДНК». Биомол англ . 22 (4): 129–32. doi : 10.1016/j.bioeng.2005.05.001 . ПМИД   16023891 .
• Родригес И, Ласаро Х.М., Бланко Л., Камтекар С., Берман А.Дж., Ван Дж., Стейтц Т.А., Салас М., де Вега М. (2005). «Специфический субдомен ДНК-полимеразы phi29 обеспечивает как процессивность, так и способность к смещению цепи» . Proc Natl Acad Sci США . 102 (18): 6407–12. Бибкод : 2005PNAS..102.6407R . дои : 10.1073/pnas.0500597102 . ПМЦ   1088371 . ПМИД   15845765 .
• Трунигер В., Боннин А., Лазаро Х.М., де Вега М., Салас М. (2005). «Участие «линкерной» области между экзонуклеазой и доменами полимеризации ДНК-полимеразы phi29 в связывании ДНК и TP». Джин . 348 : 89–99. дои : 10.1016/j.gene.2004.12.041 . ПМИД   15777661 .
• Уметани Н., де Маат М.Ф., Мори Т., Такеучи Х., Хун Д.С. (2005). «Синтез универсальной неметилированной контрольной ДНК путем вложенной амплификации всего генома с помощью ДНК-полимеразы phi29». Биохим. Биофиз. Рез. Коммун . 329 (1): 219–23. дои : 10.1016/j.bbrc.2005.01.088 . ПМИД   15721296 .
• Гадкар В., Риллиг MC (2005). «Применение ДНК-полимеразы Phi29, опосредованной амплификацией всего генома, на одиночных спорах арбускулярных микоризных (АМ) грибов» . FEMS Microbiol Lett . 242 (1): 65–71. дои : 10.1016/j.femsle.2004.10.041 . ПМИД   15621421 .
• Камтекар С., Берман А.Дж., Ван Дж., Лазаро Х.М., де Вега М., Бланко Л., Салас М., Стейц Т.А. (2004). «Понимание смещения цепи и процессивности на основе кристаллической структуры ДНК-полимеразы бактериофага phi29 с праймингом белка» . Мол Клетка . 16 (4): 609–18. doi : 10.1016/j.molcel.2004.10.019 . ПМИД   15546620 .
• Адачи Э., Симамура К., Вакамацу С., Кодама Х. (2004). «Амплификация геномной ДНК растений с помощью ДНК-полимеразы Phi29 для использования в физическом картировании гиперметилированной геномной области». Представитель растительных клеток . 23 (3): 144–7. дои : 10.1007/s00299-004-0806-y . ПМИД   15168072 . S2CID   11041367 .
• Родригес И., Ласаро Х.М., Салас М., Де Вега М. (2004). «Взаимодействие ДНК-полимеразы phi29 с концевым белком. Участие остатков, специфически консервативных среди ДНК-полимераз с белком». Дж Мол Биол . 337 (4): 829–41. дои : 10.1016/j.jmb.2004.02.018 . ПМИД   15033354 .
• Иноуэ-Нагата АК, Альбукерке LC, Роча ВБ, Нагата Т (2004). «Простой метод клонирования полного генома бегомовируса с использованием ДНК-полимеразы бактериофага phi29». Дж. Вироловые методы . 116 (2): 209–11. дои : 10.1016/j.jviromet.2003.11.015 . ПМИД   14738990 .
• Трунигер В., Лазаро Х.М., Салас М. (2004). «Функция С-конца ДНК-полимеразы phi29 в связывании ДНК и терминального белка» . Нуклеиновые кислоты Рез . 32 (1): 361–70. дои : 10.1093/nar/gkh184 . ПМЦ   373294 . ПМИД   14729920 .
• Трунигер В., Лазаро Х.М., Салас М. (2004). «Два положительно заряженных остатка ДНК-полимеразы phi29, консервативных в ДНК-полимеразах с белком, участвуют в стабилизации входящего нуклеотида». Дж Мол Биол . 335 (2): 481–94. дои : 10.1016/j.jmb.2003.10.024 . ПМИД   14672657 .
• Родригес I, Ласаро Х.М., Салас М., де Вега М. (2003). «Остаток ДНК-полимеразы phi29 Phe128 высококонсервативного мотива (S/T)Lx(2)h необходим для стабильного и функционального взаимодействия с концевым белком». Дж Мол Биол . 325 (1): 85–97. дои : 10.1016/S0022-2836(02)01130-0 . ПМИД   12473453 .
• Нельсон-младший, Кай Ю.К., Гислер Т.Л., Фаршаус Дж.В., Сундарам С.Т., Ортис-Ривера М., Хоста Л.П., Хьюитт П.Л., Мамоне Дж.А., Паланиаппан С., Фуллер К.В. (2002). «TempliPhi, амплификация матриц для секвенирования ДНК на основе ДНК-полимеразы phi29». БиоТехники . Приложение: 44–7. ПМИД   12083397 .
• Трунигер В., Ласаро Х.М., Бланко Л., Салас М. (2002). «Высококонсервативный остаток лизина в ДНК-полимеразе phi29 важен для правильного связывания шаблонного нуклеотида во время инициации репликации ДНК phi29». Дж Мол Биол . 318 (1): 83–96. дои : 10.1016/S0022-2836(02)00022-0 . ПМИД   12054770 .
• Трунигер В., Ласаро Х.М., Эстебан Ф.Дж., Бланко Л., Салас М. (2002). «Положительно заряженный остаток ДНК-полимеразы phi29, высококонсервативный в ДНК-полимеразах семейств А и В, участвует в связывании входящего нуклеотида» . Нуклеиновые кислоты Рез . 30 (7): 1483–92. дои : 10.1093/нар/30.7.1483 . ПМК   101840 . ПМИД   11917008 .
• Эйзенбрандт Р., Лазаро Х.М., Салас М., де Вега М. (2002). «Остатки ДНК-полимеразы Phi29 Tyr59, His61 и Phe69 высококонсервативного мотива ExoII необходимы для взаимодействия с концевым белком» . Нуклеиновые кислоты Рез . 30 (6): 1379–86. дои : 10.1093/нар/30.6.1379 . ПМЦ   101362 . ПМИД   11884636 .
• Элиас-Арнанц М., Салас М. (1999). «Разрешение лобовых столкновений между транскрипционным аппаратом и ДНК-полимеразой бактериофага phi29 зависит от транслокации РНК-полимеразы» . ЭМБО Дж . 18 (20): 5675–82. дои : 10.1093/emboj/18.20.5675 . ПМЦ   1171634 . ПМИД   10523310 .
• де Вега М., Бланко Л., Салас М. (1999). «Процессивная корректура и пространственная взаимосвязь между активными сайтами полимеразы и экзонуклеазы ДНК-полимеразы бактериофага phi29». Дж Мол Биол . 292 (1): 39–51. дои : 10.1006/jmbi.1999.3052 . ПМИД   10493855 .
• Боннин А., Ласаро Х.М., Бланко Л., Салас М. (1999). «Один тирозин предотвращает вставку рибонуклеотидов в ДНК-полимеразу phi29 эукариотического типа». Дж Мол Биол . 290 (1): 241–51. дои : 10.1006/jmbi.1999.2900 . ПМИД   10388570 .
• Трунигер В., Бланко Л., Салас М. (1999). «Роль мотива «YxGG/A» ДНК-полимеразы Phi29 в репликации с белком». Дж Мол Биол . 286 (1): 57–69. дои : 10.1006/jmbi.1998.2477 . ПМИД   9931249 .
• де Вега М., Бланко Л., Салас М. (1998). «Остаток ДНК-полимеразы phi29 Ser122, одноцепочечный ДНК-лиганд для 3'-5' экзонуклеолиза, необходим для взаимодействия с концевым белком» . J Биол Хим . 273 (44): 28966–77. дои : 10.1074/jbc.273.44.28966 . ПМИД   9786901 .
• Сатурно Дж., Ласаро Х.М., Бланко Л., Салас М. (1998). «Роль первого остатка аспартата мотива «YxDTDS» ДНК-полимеразы phi29 в качестве металлического лиганда во время синтеза ДНК как с TP-праймом, так и с ДНК-праймом» . Дж Мол Биол . 283 (3): 633–42. дои : 10.1006/jmbi.1998.2121 . ПМИД   9784372 .
• Мурти В., Мейер В.Дж., Бланко Л., Салас М. (1998). «Переключение матрицы ДНК-полимеразы в определенных участках генома phi29 вызывает накопление in vivo субгеномных молекул ДНК phi29» . Мол Микробиол . 29 (3): 787–98. дои : 10.1046/j.1365-2958.1998.00972.x . ПМИД   9723918 .
• Иллана Б., Забаллос А., Бланко Л., Салас М. (1998). «Последовательность RGD в концевом белке фага phi29 необходима для взаимодействия с ДНК-полимеразой phi29» . Вирусология . 248 (1): 12–9. дои : 10.1006/виро.1998.9276 . ПМИД   9705251 .
• де Вега М., Ласаро Х.М., Салас М., Бланко Л. (1998). «Мутационный анализ остатков ДНК-полимеразы phi29, действующих как лиганды оцДНК для 3'-5' экзонуклеолиза». Дж Мол Биол . 279 (4): 807–22. дои : 10.1006/jmbi.1998.1805 . ПМИД   9642062 .
• Бланко Л., Салас М. (1996). «Связанная структура с функцией ДНК-полимеразы phi29» . J Биол Хим . 271 (15): 8509–12. дои : 10.1074/jbc.271.15.8509 . ПМИД   8621470 .
• де Вега М., Лазаро Х.М., Салас М., Бланко Л. (1996). «Стабилизация праймер-конца в 3'-5'-активном сайте экзонуклеазы ДНК-полимеразы phi29. Участие двух высококонсервативных аминокислотных остатков в корректуре ДНК-полимераз» . ЭМБО Дж . 15 (5): 1182–92. дои : 10.1002/j.1460-2075.1996.tb00457.x . ПМК   450017 . ПМИД   8605889 .