Тест на нуклеиновую кислоту
Тест нуклеиновой кислоты ( NAT ) — это метод, используемый для обнаружения определенной последовательности нуклеиновой кислоты и, таким образом, обычно для обнаружения и идентификации определенного вида или подвида организма, часто вируса или бактерии , которые действуют как патоген в крови , тканях , моче , и т. д. NAT отличаются от других тестов тем, что они обнаруживают генетические материалы ( РНК или ДНК ), а не антигены или антитела . Обнаружение генетического материала позволяет раннюю диагностику заболевания, поскольку обнаружение антигенов и/или антител требует времени, чтобы они начали появляться в кровотоке. [1] Поскольку количество определенного генетического материала обычно очень мало, многие NAT включают этап, который амплифицирует генетический материал, то есть создает множество его копий. Такие NAT называются тестами амплификации нуклеиновых кислот ( NAAT ). Существует несколько способов амплификации, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), анализ замещения цепи (SDA), анализ, опосредованный транскрипцией (ТМА), [2] и петлевая изотермическая амплификация (LAMP). [3]
Практически все методы амплификации нуклеиновых кислот и технологии обнаружения используют специфичность спаривания оснований Уотсона-Крика ; Молекулы одноцепочечного зонда или праймера захватывают ДНК или РНК целевые молекулы комплементарных цепей . Таким образом, конструкция нитей зонда очень важна для повышения чувствительности и специфичности обнаружения. Однако мутанты , составляющие генетическую основу ряда заболеваний человека, обычно немного отличаются от нормальных нуклеиновых кислот. Часто они отличаются только одним основанием, например, инсерциями , делециями и однонуклеотидными полиморфизмами (SNP). В этом случае может легко произойти несовершенное связывание зонда с мишенью, что приведет к ложноположительным например, к ошибочному принятию штамма комменсального результатам , за патогенный. Много исследований было посвящено достижению одноосновной специфичности.
Авансы
[ редактировать ]Нити нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК) с соответствующими последовательностями слипаются в парные цепочки, застегиваясь, как застежки-липучки, перевернутые в сушилке для одежды. Но каждый узел цепи не очень липкий, поэтому двухцепочечная цепь постоянно частично расстегивается и снова застегивается под воздействием вибраций окружающей среды (называемых тепловым шумом или броуновским движением ). Более длинные пары более стабильны. В тестах на нуклеиновые кислоты используется «зонд», который представляет собой длинную нить с прикрепленной к ней короткой нитью. Длинная цепь праймера имеет соответствующую (комплементарную) последовательность «целевой» цепи обнаруживаемого болезнетворного организма. Болезнетворная нить плотно прилипает к обнаженной части длинной нити праймера (так называемой «точки опоры»), а затем постепенно вытесняет короткую «защитную» нить из зонда. В конце концов, короткая защитная цепь ни с чем не связывается, и можно обнаружить несвязанный короткий праймер. В оставшейся части этого раздела представлена история исследований, необходимых для превращения этого процесса в полезный тест.
![[икона]](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/1c/Wiki_letter_w_cropped.svg/20px-Wiki_letter_w_cropped.svg.png){kind=small} | Этот раздел нуждается в расширении за счет: удобного для непрофессионала краткого обзора истории и клинического применения NAT, прежде чем он превратится в обзорную статью в журнале , состоящую всего из 3 или 4 недавних отчетов из моря биомедицинской литературы по NAT, охватывающей десятилетия. Вы можете помочь, добавив к нему . ( январь 2020 г. ) |
В 2012 году исследовательская группа Инь опубликовала статью об оптимизации специфичности гибридизации нуклеиновых кислот. [4] Они ввели «зонд обмена опоры (PC)», который состоит из предварительно гибридизованной цепи комплемента C и защитной цепи P. Нить комплемента длиннее, чем защитная цепь, и на конце имеет несвязанный хвост - точку опоры. Комплемент полностью комплементарен целевой последовательности. Когда правильная мишень (X) реагирует с зондом замены опоры (PC), P высвобождается и образуется гибридный продукт XC. Стандартная свободная энергия (∆) реакции близка к нулю. С другой стороны, если зонд обмена опорой (PC) реагирует с ложной мишенью (S), реакция продолжается, но стандартная свободная энергия увеличивается и становится менее термодинамически выгодной. Стандартная разница свободной энергии (∆∆) достаточно значительна, чтобы обеспечить очевидное различие в урожайности. Коэффициент дискриминации Q рассчитывается как результат правильной целевой гибридизации, деленный на выход ложной целевой гибридизации. В ходе экспериментов с различными зондами замены опорных точек с 5 правильными мишенями и 55 ложными мишенями с энергетически репрезентативными одноосновными изменениями (замены, делеции и вставки) группа Инь пришла к выводу, что коэффициенты дискриминации этих зондов находились в диапазоне от 3 до 100 + со средним значением. 26. Зонды надежно функционируют при температуре от 10 °C до 37 °C, от 1 до 47 мМ и при концентрациях нуклеиновых кислот от 1 нМ до 5 М. Они также выяснили, что зонды для замены опор работают надежно даже при обнаружении РНК.
После этого были изучены дальнейшие исследования. В 2013 году группа Силига опубликовала статью о флуоресцентных молекулярных зондах, в которой также используется реакция обмена опоры. [5] Это позволило оптически обнаружить правильную цель и цель SNP. Им также удалось обнаружить SNP в образцах, полученных из E. coli.
В 2015 году группа Дэвида достигла чрезвычайно высокой (более 1000) селективности однонуклеотидных вариантов (SNV), внедрив систему под названием «конкурентные композиции». [6] В этой системе они построили модель кинетической реакции основных процессов гибридизации, чтобы предсказать оптимальные значения параметров, которые варьируются в зависимости от последовательностей SNV и дикого типа (WT), от конструкции зонда и стока, а также от реагента. концентрации и условия анализа. Их модель преуспела в медианной 890-кратной селективности для 44 SNV ДНК, связанных с раком, при минимуме 200, что представляет собой как минимум 30-кратное улучшение по сравнению с предыдущими анализами, основанными на гибридизации. Кроме того, они применили эту технологию для анализа низких последовательностей VAF из геномной ДНК человека после ПЦР, а также непосредственно для синтетических последовательностей РНК.
Основываясь на этом опыте, они разработали новый метод ПЦР под названием Blocker Displacement Amplification (BDA). [7] Это термоустойчивая ПЦР, которая избирательно амплифицирует все варианты последовательностей в окне размером примерно 20 нт в 1000 раз по сравнению с последовательностями дикого типа, что позволяет легко обнаруживать и количественно оценивать сотни потенциальных вариантов, первоначально с частотой аллелей ≤ 0,1%. BDA достигает аналогичных показателей обогащения при температурах отжига от 56 °C до 64 °C. Такая температурная устойчивость способствует мультиплексному обогащению множества различных вариантов по всему геному и, кроме того, позволяет использовать недорогие и портативные термоциклирующие инструменты для обнаружения редких вариантов ДНК. BDA был проверен даже на типах образцов, включая клинические образцы бесклеточной ДНК, собранные из плазмы крови пациентов с раком легких.
Приложения
[ редактировать ]- Диагностика гонококковой и других нейсериевых инфекций: амплификация специфических N. gonorrhoeae для обнаружения. последовательностей ДНК или РНК [8]
- Диагностика урогенитальных вызванных C. trachomatis. инфекций, [9]
- Обнаружение микобактерий туберкулеза [10]
- Обнаружение РНК или ДНК ВИЧ [11]
- Обнаружение зоонозных коронавирусов [12]
- Диагностический тест на SARS-CoV-2 [13]
- Обнаружение устойчивых к антибиотикам бактерий после лечения антибиотиками [14]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ «Что такое тест на нуклеиновую кислоту (NAT)?» . Американский Красный Крест.
- ^ Геррант, Ричард Л.; Уокер, Дэвид Х.; Веллер, Питер Ф. (2011). Тропические инфекционные болезни: принципы, возбудители и практика . Эдинбург: Компания WB Saunders. стр. 184–190. ISBN 978-0-7020-3935-5 .
- ^ Парида М., Саннарангаиа С., Даш ПК, Рао П.В., Морита К. (2008). «Петлевая изотермическая амплификация (LAMP): новое поколение инновационных методов амплификации генов; перспективы клинической диагностики инфекционных заболеваний» . Обзоры по медицинской вирусологии . 18 (6): 407–21. дои : 10.1002/rmv.593 . ПМК 7169140 . ПМИД 18716992 .
- ^ Пэн Инь, Дэвид Чжан (2012). «Оптимизация специфичности гибридизации нуклеиновых кислот» . Природная химия . 4 (3): 208–214. Бибкод : 2012НатЧ...4..208Z . дои : 10.1038/NCHEM.1246 . ПМЦ 4238961 . ПМИД 22354435 .
- ^ Георг Зеелиг, Шерри Чен (2013). «Условно-флуоресцентные молекулярные зонды для обнаружения одноосновных изменений в двухцепочечной ДНК» . Природная химия . 5 (9): 782–789. Бибкод : 2013НатЧ...5..782С . дои : 10.1038/NCHEM.1713 . ПМЦ 3844531 . ПМИД 23965681 .
- ^ Дэвид Чжан, Цзюэсяо Шерри Ван (2015). «Разработка ДНК-зондов с помощью моделирования для последовательной ультраспецифической гибридизации» . Природная химия . 7 (7): 545–553. Бибкод : 2015НатЧ...7..545Вт . дои : 10.1038/NCHEM.2266 . ПМЦ 4479422 . ПМИД 26100802 .
- ^ Дэвид Чжан, Люсия Р. Ву (2017). «Мультиплексное обогащение редких вариантов ДНК посредством селективной последовательности и устойчивой к температуре амплификации» . Природная биомедицинская инженерия . 1 (9): 714–723. дои : 10.1038/s41551-017-0126-5 . ПМЦ 5969535 . ПМИД 29805844 .
- ^ Питер А. Леоне, Джозеф А. Дункан (2011). Тропические инфекционные болезни: принципы, патогены и практика (Третье изд.). Филадельфия: Эльзевир. стр. 184–190.
- ^ Фань, Хуэйчжоу (2015). Молекулярная медицинская микробиология (Второе изд.). Академическая пресса. стр. 1449–1469.
- ^ Риддерхоф, Джон С. (2009). Туберкулез . Эльзевир. стр. 738–745.
- ^ Гиллеспи, Сьюзен Л. (2013). Клиническая иммунология (Четвертое изд.). Эльзевир. стр. 465–479.
- ^ Шмидт, Майкл; Брикснер, Вероника; Растер, Бриджит; Хурфар, Майкл К.; Дростен, Кристиан ; Прейзер, Вольфганг; Зейфрид, Эрхард; Рот, В. Курт (апрель 2004 г.). «NAT-скрининг доноров крови на наличие коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома потенциально может предотвратить передачу, связанную с переливанием крови» . Переливание . 44 (4): 470–475. дои : 10.1111/j.1537-2995.2004.03269.x . ISSN 0041-1132 . ПМК 7201871 . ПМИД 15043560 .
- ^ Центр по контролю и профилактике заболеваний (11 февраля 2020 г.). «Лаборатории» . Центры по контролю и профилактике заболеваний . Проверено 1 сентября 2021 г.
- ^ «СтекПуть» . www.mlo-online.com . 24 мая 2016 года . Проверено 1 апреля 2022 г.