Лизоцим ПЭГилирование

ПЭГилирование лизоцима представляет собой ковалентное присоединение полиэтиленгликоля (ПЭГ) к лизоциму, который является одним из наиболее широко изученных ПЭГилированных белков.

ПЭГилирование . белков стало обычной практикой современных терапевтических препаратов, поскольку этот процесс способен повысить растворимость, термическую стабильность, устойчивость к ферментативному разложению и период полувыведения интересующих белков из сыворотки ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} Лизоцим , как природный бактерицидный фермент, лизирует клеточную стенку различных грамположительных бактерий и обеспечивает защиту от микробных инфекций. ^{[ 2 ]} Лизоцим имеет шесть остатков лизина, которые доступны для реакций ПЭГилирования. ^{[ 3 ]} Таким образом, ПЭГилирование лизоцима . или ПЭГилирование лизоцима может быть хорошей модельной системой для ПЭГилирования других белков с ферментативной активностью, демонстрируя повышение его физической и термической стабильности при сохранении активности ^{[ 2 ]}

Предыдущие работы по ПЭГилированию лизоцима показали различные хроматографические схемы для очистки ПЭГилированного лизоцима, которые включали ионообменную хроматографию , хроматографию гидрофобного взаимодействия и эксклюзионную хроматографию ( быстрая белковая жидкостная хроматография ), и доказали его стабильную конформацию посредством кругового дихроизма и улучшенную термическую стабильность. с помощью анализа ферментативной активности, SDS-PAGE и эксклюзионной хроматографии ( высокоэффективная жидкостная хроматография). хроматография ). ^{[ 1 ]}^{[ 4 ]}^{[ 5 ]}

Методология

ПЭГилирование

Химическая модификация лизоцима путем ПЭГилирования включает добавление к белку метокси-ПЭГ-альдегида (мПЭГ-альдегида) с различными размерами молекул в диапазоне от 2 кДа до 40 кДа. ^{[ 6 ]}^{[ 7 ]} Белок и мПЭГ-альдегид растворяют с использованием натрий-фосфатного буфера с цианоборгидридом натрия , который действует как восстанавливающий агент и обуславливает сильное сродство альдегидной группы мПЭГ-альдегида к остатку лизина на N-конце лизоцима. ^{[ 7 ]} Обычно используемое молярное соотношение лизоцима и мПЭГ-альдегида составляет 1:6 или 1:6,67. ^{[ 6 ]}^{[ 5 ]} Когда достигается достаточное ПЭГилирование , реакцию можно остановить добавлением лизина к раствору или кипячением раствора. ^{[ 2 ]}^{[ 8 ]} Различные профили могут привести к ПЭГилированию белка, который включает интактные моно-ПЭГилированные, ди-ПЭГилированные, три-ПЭГилированные, а также, возможно, их изоформы . ^{[ 5 ]}

Очистка

Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография часто используется на первом этапе или этапе захвата для разделения ПЭГилированных белков, поскольку ПЭГилирование может влиять на заряды целевых белков путем нейтрализации электростатического взаимодействия , изменения изоэлектрической точки (pI) и увеличения значения pKa . ^{[ 2 ]} Из-за высокого pI лизоцима (pI = 10,7) применяют катионообменную хроматографию. ^{[ 2 ]}^{[ 9 ]} Поскольку повышенная степень ПЭГилирования снижает ионную силу белка, полиПЭГилированные белки имеют тенденцию связываться с катионной смолой слабее, чем моноПЭГилированный белок или интактная форма. Таким образом, поли-ПЭГилированные белки элюируются быстрее, а интактный белок ускользает последним при катионообменной хроматографии. ^{[ 10 ]} Поскольку моно-ПЭГилирование широко исследуется и описывается как защита целевых белков, целевым элюатом при катионообменной хроматографии обычно являются моно-ПЭГилированные белки. ^{[ 7 ]}

Хроматография гидрофобного взаимодействия

Несмотря на возможности катионообменной хроматографии в процессе очистки, также используется хроматография гидрофобного взаимодействия , обычно на втором этапе в качестве этапа очистки. Используя катионную смолу относительно небольшого размера, катионообменная хроматография может идентифицировать и разделять изоформы по кажущимся зарядам в состоянии, но хроматография гидрофобного взаимодействия способна идентифицировать и разделять изоформы по их гидрофобности. ^{[ 11 ]}

Эксклюзионная хроматография (FPLC)

Из-за очевидных различий в размерах в зависимости от степени ПЭГилирования белка эксклюзионную хроматографию ( быстрая белковая жидкостная хроматография или FPLC). можно использовать ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]} Существует отрицательная корреляция между молекулярной массой и временем удерживания ПЭГилированного белка на хроматограмме; более крупный белок или более ПЭГилированный белок элюируется первым, а меньший белок или интактный белок элюируется последним. ^{[ 2 ]}

Характеристика

Идентификация

Наиболее распространенные анализы для идентификации интактного и ПЭГилированного лизоцима можно проводить с помощью эксклюзионной хроматографии ( высокоэффективной жидкостной хроматографии или ВЭЖХ), SDS-PAGE и матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI) . ^{[ 2 ]}

Телосложение

Вторичную структуру интактного и ПЭГилированного лизоцима можно охарактеризовать с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД) . ^{[ 4 ]}^{[ 7 ]} Спектры КД в диапазоне 189-260 нм с шагом 0,1 нм не показали существенных изменений во вторичной структуре интактного и ПЭГилированного лизоцима. ^{[ 4 ]}^{[ 7 ]}

Анализ ферментативной активности

Гликоль хитозан

Ферментативную активность интактного и ПЭГилированного лизоцима можно оценить с использованием гликолевого хитозана путем взаимодействия 1 мл 0,05% (мас./об.) гликолевого хитозана в 100 мМ ацетатного буфера с pH 5,5 и 100 мкл интактного или ПЭГилированного белка при 40 °C в течение 30 минут. мин и последующее добавление 2 мл 0,5 М карбоната натрия с 1 мкг феррицианид калия . ^{[ 12 ]} Смесь сразу нагревают, кипятят 15 минут и охлаждают для спектрального анализа при 420 нм. ^{[ 12 ]} Поскольку ферментативная активность по гидролизу β-1,4-N-ацетилглюкозаминовой связи сохранялась после ПЭГилирования, не наблюдалось снижения ферментативной активности при увеличении степени ПЭГилирования. ^{[ 4 ]}

Микрококк лизодейктикус

путем измерения уменьшения мутности M. lysodeikticus при инкубации его с лизоцимом . Ферментативную активность можно оценить ^{[ 13 ]} 7,5 мкл белков в концентрации 0,1–1 мг/мл добавляют к 200 мкл M. lysodeikticus при его оптической плотности (ОП) 1,7 AU и смесь периодически измеряют при длине волны 450 нм для расчета скорости реакции. ^{[ 5 ]}^{[ 13 ]} В отличие от результата по ферментативной активности гликоля и хитозана, увеличение степени ПЭГилирования снижало ферментативную активность. ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]} Эта разница в тенденции ферментативной активности может быть связана с ПЭГилированием до свободного лизина, вызывающего стерические препятствия и впоследствии препятствующего образованию фермент-субстратного комплекса в случае реакции с макромолекулами, такими как M. lysodeikticus. ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]}^{[ 14 ]}

Ссылки

^ Перейти обратно: ^а ^б Плата, Конан (18 сентября 2009 г.). ПЭГилированные белковые препараты: фундаментальная наука и клиническое применение . Биркхойзер. стр. 113–124. ISBN 978-3-7643-8678-8 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час да Силва Фрейтас, Дебора; Абраао-Нето, Хосе (15 июня 2010 г.). «Биохимическая и биофизическая характеристика лизоцима, модифицированного ПЭГилированием» . Международный фармацевтический журнал . 392 (1–2): 111–117. doi : 10.1016/j.ijpharm.2010.03.036 . ПМИД 20307635 .
^ «Исследование характеристик ПЭГилированного лизоцима» . Ученый-аналитик . 29 сентября 2014 года . Проверено 17 июля 2020 г.
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г да Силва Фрейтас, Дебора; Абраао-Нето, Хосе (15 июня 2010 г.). «Биохимическая и биофизическая характеристика лизоцима, модифицированного ПЭГилированием» . Международный фармацевтический журнал . 392 (1–2): 111–117. doi : 10.1016/j.ijpharm.2010.03.036 . ПМИД 20307635 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г Пай, Шитал С.; Хаммуда, Буалем; Хун, Куньлунь; Поццо, Данило К.; Пшибицен, Тодд М.; Тилтон, Роберт Д. (16 ноября 2011 г.). «Конформация цепи поли(этиленгликоля) в моно-ПЭГилированном лизоциме и моно-ПЭГилированном гормоне роста человека». Биоконъюгатная химия . 22 (11): 2317–2323. дои : 10.1021/bc2003583 . ISSN 1043-1802 . ПМИД 21950579 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Моргенштерн, Жозефина; Бауманн, Паскаль; Бруннер, Карина; Хуббух, Юрген (19 января 2017 г.). «Влияние молекулярной массы ПЭГ и степени ПЭГилирования на физическую стабильность ПЭГилированного лизоцима». Международный фармацевтический журнал . 519 (1–2): 408–417. doi : 10.1016/j.ijpharm.2017.01.040 . ПМИД 28130198 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Майзер, Бенджамин; Дисмер, Флориан; Хуббух, Юрген (2014). «Оптимизация случайных реакций ПЭГилирования посредством высокопроизводительного скрининга». Биотехнология и биоинженерия . 111 (1): 104–114. дои : 10.1002/бит.25000 . ISSN 1097-0290 . ПМИД 23939788 . S2CID 205503389 .
^ Оттоу, Ким Экелунд; Лунд-Олесен, Торстен; Мори, Трине Люткен; Хансен, Миккель Фугт; Хобли, Тимоти Дж. (2011). «Процесс полунепрерывного ПЭГилирования белков на основе магнитного адсорбента». Биотехнологический журнал . 6 (4): 396–409. дои : 10.1002/biot.201000360 . ISSN 1860-7314 . ПМИД 21259443 .
^ Абейратне, EDNS; Ли, Хай; Ан, ДУ (11 декабря 2014 г.). «Последовательное отделение лизоцима, овомуцина, овотрансферрина и овальбумина из яичного белка» . Птицеводство . 93 (4): 1001–1009. дои : 10.3382/ps.2013-03403 . ПМИД 24706978 .
^ Плата, Конан Дж.; Ван Алстайн, Джеймс М. (08 ноября 2005 г.). «ПЭГ-белки: вопросы реакционной техники и разделения». Химико-техническая наука . 61 (3): 924–939. дои : 10.1016/j.ces.2005.04.040 .
^ Ли, КЦ; Так, К.К.; Парк, Миссури; Ли, Джей Ти; Ву, Б.Х.; Йоу, СД; Ли, HS; ДеЛука, ПП (1 мая 1999 г.). «Получение и характеристика модифицированных полиэтиленгликолем кальцитонинов лосося». Фармацевтические разработки и технологии . 4 (2): 269–275. дои : 10.1081/PDT-100101361 . ISSN 1083-7450 . ПМИД 10231888 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Имото, Тайдзи; Ягишита, Кадзуёси (24 апреля 1971 г.). «Простое измерение активности лизоцима». Сельскохозяйственная и биологическая химия . 35 (7): 1154–1156. дои : 10.1080/00021369.1971.10860050 . ISSN 0002-1369 .
^ Перейти обратно: ^а ^б Шугар, Дэвид (29 марта 1952 г.). «Измерение активности лизоцима и ультрафиолетовая инактивация лизоцима». Биохимика и биофизика Acta . 8 (3): 302–309. дои : 10.1016/0006-3002(52)90045-0 . ПМИД 14934741 .
^ Нодаке, Юичи; Ямасаки, Нобуюки (25 ноября 1999 г.). «Некоторые свойства макромолекулярного конъюгата лизоцима, полученного модификацией производным монометоксиполиэтиленгликоля» . Бионауки, биотехнологии и биохимия . 64 (4): 767–774. дои : 10.1271/bbb.64.767 . ISSN 0916-8451 . ПМИД 10830491 . S2CID 2851002 .

[:1-1] Перейти обратно: ^а ^б Плата, Конан (18 сентября 2009 г.). ПЭГилированные белковые препараты: фундаментальная наука и клиническое применение . Биркхойзер. стр. 113–124. ISBN 978-3-7643-8678-8 .

[:0-2] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час да Силва Фрейтас, Дебора; Абраао-Нето, Хосе (15 июня 2010 г.). «Биохимическая и биофизическая характеристика лизоцима, модифицированного ПЭГилированием» . Международный фармацевтический журнал . 392 (1–2): 111–117. doi : 10.1016/j.ijpharm.2010.03.036 . ПМИД 20307635 .

[3] «Исследование характеристик ПЭГилированного лизоцима» . Ученый-аналитик . 29 сентября 2014 года . Проверено 17 июля 2020 г.

[:5-4] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г да Силва Фрейтас, Дебора; Абраао-Нето, Хосе (15 июня 2010 г.). «Биохимическая и биофизическая характеристика лизоцима, модифицированного ПЭГилированием» . Международный фармацевтический журнал . 392 (1–2): 111–117. doi : 10.1016/j.ijpharm.2010.03.036 . ПМИД 20307635 .

[:3-5] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г Пай, Шитал С.; Хаммуда, Буалем; Хун, Куньлунь; Поццо, Данило К.; Пшибицен, Тодд М.; Тилтон, Роберт Д. (16 ноября 2011 г.). «Конформация цепи поли(этиленгликоля) в моно-ПЭГилированном лизоциме и моно-ПЭГилированном гормоне роста человека». Биоконъюгатная химия . 22 (11): 2317–2323. дои : 10.1021/bc2003583 . ISSN 1043-1802 . ПМИД 21950579 .

[:2-6] Перейти обратно: ^а ^б Моргенштерн, Жозефина; Бауманн, Паскаль; Бруннер, Карина; Хуббух, Юрген (19 января 2017 г.). «Влияние молекулярной массы ПЭГ и степени ПЭГилирования на физическую стабильность ПЭГилированного лизоцима». Международный фармацевтический журнал . 519 (1–2): 408–417. doi : 10.1016/j.ijpharm.2017.01.040 . ПМИД 28130198 .

[:4-7] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Майзер, Бенджамин; Дисмер, Флориан; Хуббух, Юрген (2014). «Оптимизация случайных реакций ПЭГилирования посредством высокопроизводительного скрининга». Биотехнология и биоинженерия . 111 (1): 104–114. дои : 10.1002/бит.25000 . ISSN 1097-0290 . ПМИД 23939788 . S2CID 205503389 .

[8] Оттоу, Ким Экелунд; Лунд-Олесен, Торстен; Мори, Трине Люткен; Хансен, Миккель Фугт; Хобли, Тимоти Дж. (2011). «Процесс полунепрерывного ПЭГилирования белков на основе магнитного адсорбента». Биотехнологический журнал . 6 (4): 396–409. дои : 10.1002/biot.201000360 . ISSN 1860-7314 . ПМИД 21259443 .

[9] Абейратне, EDNS; Ли, Хай; Ан, ДУ (11 декабря 2014 г.). «Последовательное отделение лизоцима, овомуцина, овотрансферрина и овальбумина из яичного белка» . Птицеводство . 93 (4): 1001–1009. дои : 10.3382/ps.2013-03403 . ПМИД 24706978 .

[10] Плата, Конан Дж.; Ван Алстайн, Джеймс М. (08 ноября 2005 г.). «ПЭГ-белки: вопросы реакционной техники и разделения». Химико-техническая наука . 61 (3): 924–939. дои : 10.1016/j.ces.2005.04.040 .

[11] Ли, КЦ; Так, К.К.; Парк, Миссури; Ли, Джей Ти; Ву, Б.Х.; Йоу, СД; Ли, HS; ДеЛука, ПП (1 мая 1999 г.). «Получение и характеристика модифицированных полиэтиленгликолем кальцитонинов лосося». Фармацевтические разработки и технологии . 4 (2): 269–275. дои : 10.1081/PDT-100101361 . ISSN 1083-7450 . ПМИД 10231888 .

[:6-12] Перейти обратно: ^а ^б Имото, Тайдзи; Ягишита, Кадзуёси (24 апреля 1971 г.). «Простое измерение активности лизоцима». Сельскохозяйственная и биологическая химия . 35 (7): 1154–1156. дои : 10.1080/00021369.1971.10860050 . ISSN 0002-1369 .

[:7-13] Перейти обратно: ^а ^б Шугар, Дэвид (29 марта 1952 г.). «Измерение активности лизоцима и ультрафиолетовая инактивация лизоцима». Биохимика и биофизика Acta . 8 (3): 302–309. дои : 10.1016/0006-3002(52)90045-0 . ПМИД 14934741 .

[14] Нодаке, Юичи; Ямасаки, Нобуюки (25 ноября 1999 г.). «Некоторые свойства макромолекулярного конъюгата лизоцима, полученного модификацией производным монометоксиполиэтиленгликоля» . Бионауки, биотехнологии и биохимия . 64 (4): 767–774. дои : 10.1271/bbb.64.767 . ISSN 0916-8451 . ПМИД 10830491 . S2CID 2851002 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]