Ферментный анализ

Спектрофотометр УФ/ВИД Beckman DU640

Ферментные анализы — это лабораторные методы измерения ферментативной активности. Они жизненно важны для изучения кинетики ферментов и ингибирования ферментов .

Ферментные единицы

Количество или концентрация фермента может быть выражена в молярных количествах, как и в случае любого другого химического вещества, или в единицах активности фермента .

Ферментативная активность

Ферментативная активность является мерой количества присутствующего активного фермента и, таким образом, зависит от различных физических условий, которые следует указать .

Он рассчитывается по следующей формуле:

$\mathrm {a} =\mathrm {n} _{\text{t}}=\mathrm {r} \times \mathrm {V}$

где

$\mathrm {a}$ = Ферментативная активность

$\mathrm {n} _{\text{t}}$ = Моли субстрата, пересчитанные в единицу времени

$\mathrm {r}$ = Скорость реакции

$\mathrm {V}$ = Объем реакции

Единица СИ — катал , 1 катал = 1 моль с. ⁻¹ (моль в секунду), но это слишком большая единица. Более практичным и часто используемым значением является ферментная единица (U) = 1 мкмоль мин. ⁻¹ (микромоль в минуту). 1 U соответствует 16,67 нанокаталя .

Активность фермента, указанная в катале, обычно относится к активности предполагаемого природного целевого субстрата фермента. Активность фермента также может быть указана как активность некоторых стандартизированных субстратов, таких как желатин , измеряемый затем в единицах переваривания желатина (GDU), или молочных белков, затем измеряемый в единицах свертывания молока (MCU). Единицы GDU и MCU основаны на том, насколько быстро один грамм фермента переваривает желатин или молочные белки соответственно. 1 GDU примерно равен 1,5 MCU.

Увеличение количества субстрата увеличит скорость реакции с ферментами, однако после определенного момента скорость реакции выровняется, поскольку количество доступных активных центров остается постоянным.

Конкретная деятельность

Еще одной общей единицей является удельная активность фермента. Это активность фермента на миллиграмм общего белка (выраженная в мкмоль мин. ⁻¹ мг ⁻¹ ). Удельная активность позволяет оценить чистоту фермента в смеси. Это микромоль продукта, образованного ферментом за определенный промежуток времени (минуты) в определенных условиях на миллиграмм общего количества белков. Удельная активность равна скорости реакции, умноженной на объем реакции, деленный на массу общего белка. Единица СИ — катал/кг, но более практичная единица — мкмоль/мгмин.

Удельная активность является мерой процессивности фермента (способности фермента обрабатываться) при определенной (обычно насыщающей) концентрации субстрата и обычно является постоянной для чистого фермента.

Процесс титрования активного центра можно провести для устранения ошибок, возникающих из-за различий в партиях культивирования и/или неправильной укладки фермента и подобных проблем. Это мера количества активного фермента, рассчитанная, например, путем титрования количества присутствующих активных центров с использованием необратимого ингибитора. Тогда удельную активность следует выражать в мкмоль мин. ⁻¹ мг ⁻¹ активный фермент. Если известна молекулярная масса фермента, число оборотов или произведение мкмоль в секунду на мкмоль активного фермента можно рассчитать на основе удельной активности. Число оборотов можно представить как количество раз, которое каждая молекула фермента выполняет свой каталитический цикл в секунду.

Сопутствующая терминология

Скорость реакции — это концентрация исчезающего субстрата (или образующегося продукта) в единицу времени (моль л ⁻¹ с ⁻¹ ).

% чистоты составляет 100% × (удельная активность образца фермента / удельная активность чистого фермента). Нечистый образец имеет более низкую удельную активность, поскольку некоторая часть массы на самом деле не является ферментом. Если известна удельная активность 100% чистого фермента, то нечистый образец будет иметь более низкую удельную активность, что позволит рассчитать чистоту и затем получить четкий результат.

Типы анализов

Все ферментные анализы измеряют либо потребление субстрата, либо выработку продукта с течением времени. Существует большое количество различных методов измерения концентраций субстратов и продуктов, и многие ферменты можно анализировать несколькими различными способами. Биохимики обычно изучают реакции, катализируемые ферментами, используя четыре типа экспериментов:

• Эксперименты с начальной скоростью . Когда фермент смешивается с большим избытком субстрата, промежуточное соединение фермент-субстрат образуется в быстром начальном переходном режиме. Затем реакция достигает стационарной кинетики, при которой промежуточные соединения фермента-субстрата остаются примерно постоянными во времени, а скорость реакции изменяется относительно медленно. Скорость измеряется в течение короткого периода после достижения квазистационарного состояния, обычно путем мониторинга накопления продукта с течением времени. Поскольку измерения проводятся в течение очень короткого периода времени и из-за большого избытка подложки, можно сделать приближение, что количество свободной подложки примерно равно количеству исходной подложки. Эксперимент с начальной скоростью является самым простым для выполнения и анализа, поскольку он относительно свободен от таких осложнений, как обратная реакция и деградация ферментов. Таким образом, это, безусловно, наиболее часто используемый тип экспериментов по кинетике ферментов.
• Эксперименты с кривой прогресса . В этих экспериментах кинетические параметры определяются из выражений для концентрации частиц в зависимости от времени. Концентрацию субстрата или продукта регистрируют во времени после первоначального быстрого переходного процесса и в течение достаточно длительного периода, чтобы позволить реакции приблизиться к равновесию. Эксперименты с кривой прогресса широко использовались в ранний период изучения кинетики ферментов, но сейчас они менее распространены.
• Эксперименты по переходной кинетике . В этих экспериментах поведение реакции отслеживается во время начального быстрого переходного процесса, когда промежуточное соединение достигает периода установившейся кинетики. Эти эксперименты труднее проводить, чем любой из двух вышеуказанных классов, поскольку они требуют специальных методов (таких как флэш-фотолиз клеточных соединений) или быстрого смешивания (например, остановленный поток , погашенный поток или непрерывный поток).
• Релаксационные эксперименты . В этих экспериментах равновесная смесь фермента, субстрата и продукта нарушается, например, из-за скачка температуры , давления или pH, и отслеживается возвращение к равновесию. Анализ этих экспериментов требует рассмотрения полностью обратимой реакции. Более того, эксперименты по релаксации относительно нечувствительны к деталям механизма и поэтому обычно не используются для идентификации механизма, хотя они могут проводиться при соответствующих условиях.

Ферментные анализы можно разделить на две группы в зависимости от метода отбора проб: непрерывные анализы , при которых анализ дает непрерывные показания активности, и прерывистые анализы , при которых отбираются пробы, реакция останавливается, а затем определяется концентрация субстратов/продуктов.

с регулируемой температурой Держатель кювет в спектрофотометре.

Непрерывные анализы

Непрерывные анализы наиболее удобны: один анализ позволяет определить скорость реакции без необходимости дополнительной работы. Существует много различных типов непрерывных анализов.

Спектрофотометрический

В спектрофотометрических анализах вы следите за ходом реакции, измеряя изменение количества света, поглощаемого аналитическим раствором. Если этот свет находится в видимой области, вы действительно можете увидеть изменение цвета анализа, и это называется колориметрическим анализом . МТТ -анализ , окислительно-восстановительный анализ с использованием красителя тетразолия в качестве субстрата, является примером колориметрического анализа.

Часто используется УФ-свет, поскольку обычные коферменты НАДН и НАДФН поглощают УФ-свет в восстановленных формах, но не в окисленных формах. Таким образом, оксидоредуктазу , использующую НАДН в качестве субстрата, можно анализировать, наблюдая за уменьшением поглощения УФ-излучения при длине волны 340 нм по мере поглощения кофермента.

Прямые и связанные анализы

Совмещенный анализ на гексокиназу с использованием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы .

Даже если ферментативная реакция не приводит к изменению светопоглощения, все равно можно использовать спектрофотометрический анализ фермента с помощью связанного анализа . Здесь продукт одной реакции используется в качестве субстрата другой, легко обнаруживаемой реакции. Например, на рисунке 1 показан совмещенный анализ фермента гексокиназы , который можно провести путем объединения продукции глюкозо-6-фосфата с выработкой НАДФН с использованием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы .

флюорометрический

Флуоресценция – это когда молекула излучает свет одной длины волны после поглощения света другой длины волны. Флуорометрические анализы используют разницу во флуоресценции субстрата и продукта для измерения ферментативной реакции. Эти анализы, как правило, гораздо более чувствительны, чем спектрофотометрические анализы, но могут страдать от помех, вызванных примесями и нестабильностью многих флуоресцентных соединений при воздействии света.

Примером этих анализов снова является использование нуклеотидных коферментов НАДН и НАДФН. Здесь восстановленные формы флуоресцируют, а окисленные формы нефлуоресцируют. Поэтому реакции окисления могут сопровождаться уменьшением флуоресценции, а реакции восстановления - увеличением. Также доступны синтетические субстраты, которые выделяют флуоресцентный краситель в реакции, катализируемой ферментами, такие как 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозид для анализа β-галактозидазы или 4-метилумбеллиферилбутират для анализа Candida Rugosa липазы .

Калориметрический

Хемилюминесценция люминола

Калориметрия – это измерение тепла, выделяемого или поглощаемого в результате химических реакций. Эти анализы являются очень общими, поскольку многие реакции включают некоторое изменение температуры, а при использовании микрокалориметра не требуется большого количества ферментов или субстратов. Эти анализы можно использовать для измерения реакций, которые невозможно оценить каким-либо другим способом.

хемилюминесцентный

Хемилюминесценция – это излучение света в результате химической реакции. Некоторые ферментативные реакции производят свет, и его можно измерить, чтобы обнаружить образование продукта. Эти типы анализа могут быть чрезвычайно чувствительными, поскольку излучаемый свет может быть зафиксирован фотопленкой в ​​течение нескольких дней или недель, но их трудно определить количественно, поскольку не весь свет, выделяемый в результате реакции, будет обнаружен.

Обнаружение пероксидазы хрена методом ферментативной хемилюминесценции (ECL) является распространенным методом обнаружения антител при вестерн-блоттинге . Другим примером является фермент люцифераза , он обнаружен у светлячков и естественным образом производит свет из своего субстрата люциферина.

Рассеяние света

Статическое светорассеяние измеряет произведение средневесовой молярной массы и концентрации макромолекул в растворе. При фиксированной общей концентрации одного или нескольких видов в течение времени измерения сигнал рассеяния является прямой мерой средневесовой молярной массы раствора, которая будет меняться по мере образования или диссоциации комплексов. Следовательно, измерение количественно определяет стехиометрию комплексов, а также кинетику. Анализ кинетики белков по светорассеянию представляет собой очень общий метод, не требующий фермента.

Микромасштабный термофорез

Микромасштабный термофорез (МСТ) измеряет размер, заряд и энтропию гидратации молекул/субстратов в равновесии. Термофоретическое движение флуоресцентно меченного субстрата существенно меняется по мере его модификации ферментом. Эту ферментативную активность можно измерить с высоким временным разрешением в режиме реального времени. Расход материала при использовании полностью оптического метода MST очень низок: для измерения констант скорости ферментов для активности и ингибирования требуется всего 5 мкл объема образца и концентрация фермента 10 нМ. MST позволяет аналитикам измерять модификацию двух разных субстратов одновременно ( мультиплексирование ), если оба субстрата помечены разными флуорофорами. Таким образом, можно проводить эксперименты по конкуренции субстратов.

Прерывистые анализы

Прерывистые анализы - это когда образцы ферментативной реакции отбираются через определенные промежутки времени и в этих образцах измеряется количество продукции продукта или потребления субстрата.

Радиометрический

Радиометрические анализы измеряют включение радиоактивности в субстраты или ее высвобождение из субстратов. Радиоактивные изотопы, наиболее часто используемые в этих анализах: ¹⁴ С, ³² П, ³⁵ Песок ¹²⁵ I. Поскольку радиоактивные изотопы позволяют специфично маркировать один атом субстрата, эти анализы чрезвычайно чувствительны и специфичны. Они часто используются в биохимии и часто являются единственным способом измерения конкретной реакции в неочищенных экстрактах (сложных смесях ферментов, образующихся при лизисе клеток).

Радиоактивность обычно измеряется в ходе этих процедур с использованием сцинтилляционного счетчика .

хроматографический

Хроматографические анализы измеряют образование продукта путем разделения реакционной смеси на компоненты с помощью хроматографии . Обычно это делается с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), но можно также использовать более простой метод тонкослойной хроматографии . Хотя для этого подхода может потребоваться много материала, его чувствительность можно повысить, маркируя субстраты/продукты радиоактивной или флуоресцентной меткой. Чувствительность анализа также была повышена за счет переключения протоколов на улучшенные хроматографические инструменты (например, жидкостную хроматографию сверхвысокого давления), которые работают при давлении насоса, в несколько раз превышающем давление приборов ВЭЖХ (см. Высокоэффективная жидкостная хроматография#Давление насоса ).

Факторы, влияющие на анализы

Барокамера для измерения активности ферментов под высоким давлением.

На результат анализа влияют несколько факторов, и в недавнем обзоре суммированы различные параметры, которые необходимо отслеживать, чтобы анализ оставался в рабочем состоянии.

Концентрация соли

Большинство ферментов не переносят чрезвычайно высокие концентрации солей. Ионы мешают слабым ионным белков связям . Типичные ферменты активны при концентрациях солей 1–500 мМ. Как обычно, есть исключения, такие как галофильные водоросли и галофильные бактерии .

Влияние температуры

Все ферменты работают в диапазоне температур, специфичном для организма. Повышение температуры обычно приводит к увеличению скорости реакции. Это увеличение имеет предел, поскольку более высокие температуры приводят к резкому снижению скорости реакции. Это происходит из-за денатурации (изменения) структуры белка в результате разрушения слабых ионных и водородных связей , стабилизирующих трехмерную структуру активного центра фермента. «Оптимальная» температура для человеческих ферментов обычно составляет от 35 до 40 °C. Средняя температура для человека составляет 37°C. Человеческие ферменты начинают быстро денатурировать при температуре выше 40 °C. Ферменты термофильных архей, обнаруженные в горячих источниках, стабильны до 100 °C. Однако идея «оптимальной» скорости ферментативной реакции вводит в заблуждение, поскольку скорость, наблюдаемая при любой температуре, является произведением двух скоростей: скорости реакции и скорости денатурации. Если бы вы использовали анализ, измеряющий активность в течение одной секунды, он дал бы высокую активность при высоких температурах, однако если бы вы использовали анализ, измеряющий образование продукта в течение часа, это дало бы вам низкую активность при этих температурах.

Влияние pH

Большинство ферментов чувствительны к pH и имеют специфический диапазон активности. Все они имеют оптимальный уровень pH. Уровень pH может остановить активность фермента, денатурируя (изменяя) трехмерную форму фермента путем разрушения ионных и водородных связей . Большинство ферментов функционируют при pH от 6 до 8; однако пепсин в желудке лучше всего действует при pH 2, а трипсин — при pH 8.

Ферментное насыщение

Увеличение концентрации субстрата увеличивает скорость реакции (активность фермента). Однако насыщение ферментов ограничивает скорость реакций. Фермент считается насыщенным, когда активные центры всех молекул заняты большую часть времени. В точке насыщения реакция не ускорится, сколько бы дополнительного субстрата ни добавляли. График скорости реакции выйдет на плато.

Уровень скученности

Большие количества макромолекул в растворе изменяют скорости и константы равновесия ферментативных реакций за счет эффекта, называемого скученностью макромолекул .

Список ферментных анализов

• МТТ-анализ
• Гидролиз диацетата флуоресцеина
• пара -Нитрофенилфосфат

См. также

• Рестрикционный фермент
• Анализ ДНКазного следа
• Кинетика ферментов

Внешние ссылки

• СМИ, связанные с ферментативными анализами, на Викискладе?
• «Протоколы анализов — OpenWetWare» . OpenWetWare . Фонд BioBricks . Проверено 27 июля 2022 г.