Анализ ДНКазного следа

След ДНКазы I связывания белка с радиоактивно меченным фрагментом ДНК. Дорожки «GA» и «TC» представляют собой дорожки химического секвенирования Максама-Гилберта, см. « Секвенирование ДНК» . Полоса с надписью «контроль» предназначена для целей контроля качества и содержит фрагмент ДНК, но не обработанный ДНКазой I.

Анализ ДНКазного следа ^[1] это метод отслеживания ДНК из молекулярной биологии / биохимии, который обнаруживает взаимодействие ДНК и белка, используя тот факт, что белок, связанный с ДНК, часто защищает эту ДНК от ферментативного расщепления. Это позволяет найти сайт связывания белка на конкретной молекуле ДНК. В этом методе используется фермент дезоксирибонуклеаза (сокращенно ДНКаза) для разрезания радиоактивно меченной на концах ДНК с последующим гель-электрофорезом для обнаружения полученной картины расщепления.

Например, интересующий фрагмент ДНК можно с помощью ПЦР с использованием амплифицировать ³²Праймер, меченный P 5', в результате чего образуется множество молекул ДНК с радиоактивной меткой на одном конце одной цепи каждой двухцепочечной молекулы. Расщепление ДНКазой приводит к образованию фрагментов. Фрагменты, меньшие по размеру ³²Конец, меченный P, появится в геле дальше, чем более длинные фрагменты. Затем гель используется для экспонирования специальной фотопленки.

Характер расщепления ДНК в отсутствие ДНК-связывающего белка, обычно называемый свободной ДНК, сравнивают с характером расщепления ДНК в присутствии ДНК-связывающего белка. Если белок связывает ДНК, сайт связывания защищен от ферментативного расщепления. В результате этой защиты на геле образуется чистая область, называемая «следом».

Варьируя концентрацию ДНК-связывающего белка, можно оценить аффинность связывания белка по минимальной концентрации белка, при которой наблюдается след.

Эта техника была разработана Дэвидом Дж. Галасом и Альбертом Шмитцем в Женеве в 1977 году. ^[2]

См. также

Ссылки

^ Бреновиц М., Сенир Д.Ф., Ши М.А., Акерс Г.К. (1986). «[9] Количественное титрование следа ДНКазы: метод изучения взаимодействий белок-ДНК». Количественное титрование ДНКазного следа: метод изучения взаимодействий белок-ДНК . Методы энзимологии. Том. 130. стр. 132–81. дои : 10.1016/0076-6879(86)30011-9 . ISBN 9780121820305 . ПМИД 3773731 .
^ Гала-ди-джей, Шмитц А. (сентябрь 1978 г.). «Отпечаток ДНКазы: простой метод определения специфичности связывания белок-ДНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 5 (9): 3157–70. дои : 10.1093/нар/5.9.3157 . ПМЦ 342238 . ПМИД 212715 .

[1] Бреновиц М., Сенир Д.Ф., Ши М.А., Акерс Г.К. (1986). «[9] Количественное титрование следа ДНКазы: метод изучения взаимодействий белок-ДНК». Количественное титрование ДНКазного следа: метод изучения взаимодействий белок-ДНК . Методы энзимологии. Том. 130. стр. 132–81. дои : 10.1016/0076-6879(86)30011-9 . ISBN 9780121820305 . ПМИД 3773731 .

[2] Гала-ди-джей, Шмитц А. (сентябрь 1978 г.). «Отпечаток ДНКазы: простой метод определения специфичности связывания белок-ДНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 5 (9): 3157–70. дои : 10.1093/нар/5.9.3157 . ПМЦ 342238 . ПМИД 212715 .

[1]

[2]