следы ДНК
ДНК-следы — это метод исследования специфичности последовательностей ДНК -связывающих белков in vitro. Этот метод можно использовать для изучения взаимодействий белок-ДНК как снаружи, так и внутри клеток.
Регуляция транскрипции широко изучена, но многое еще остается неизвестным. Факторы транскрипции и связанные с ними белки, которые связывают промоторы , энхансеры или сайленсеры для управления или подавления транскрипции, имеют фундаментальное значение для понимания уникальной регуляции отдельных генов в геноме . Такие методы, как отслеживание ДНК, помогают выяснить, какие белки связываются с этими связанными областями ДНК, и разгадать сложности контроля транскрипции.
История
[ редактировать ]В 1978 году Дэвид Дж. Галас и Альберт Шмитц разработали метод отслеживания ДНК для изучения специфичности связывания белка-репрессора lac. Первоначально это была модификация метода химического секвенирования Максама-Гилберта. [1]
Метод
[ редактировать ]Простейшее применение этого метода — оценить, связывается ли данный белок с интересующей областью внутри молекулы ДНК. [2] Полимеразная цепная реакция (ПЦР) амплифицирует и метит интересующую область, которая содержит потенциальный сайт связывания белка, в идеале длина ампликона составляет от 50 до 200 пар оснований. Добавьте интересующий белок к части меченой ДНК-матрицы; часть должна оставаться отдельной без белка для последующего сравнения. Добавьте расщепляющий агент в обе части матрицы ДНК. Агент расщепления представляет собой химическое вещество или фермент, который разрезает случайные места независимо от последовательности. Реакция должна происходить ровно настолько, чтобы каждая молекула ДНК разрезалась только в одном месте. Белок, который специфически связывает участок внутри матрицы ДНК, защитит ДНК, с которой он связан, от агента расщепления. Проведите оба образца рядом с в полиакриламидном электрофорезом геле . Часть ДНК-матрицы без белка будет разрезана в случайных местах, и, таким образом, при анализе геля будет получено лестничное распределение. Матрица ДНК с белком приведет к лестничному распределению с разрывом в нем, «следу», где ДНК защищена от агента расщепления.Примечание: химикат Maxam-Gilbert. Секвенирование ДНК можно проводить вместе с образцами на полиакриламидном геле, чтобы можно было предсказать точное местоположение сайта связывания лиганда.
Маркировка
[ редактировать ]ДНК-матрица помечена на 3'- или 5'-конце, в зависимости от местоположения сайта(ов) связывания. Можно использовать следующие метки: радиоактивность и флуоресценция . Радиоактивность традиционно использовалась для маркировки фрагментов ДНК для анализа следов, поскольку этот метод изначально был разработан на основе метода химического секвенирования Максама-Гилберта. Радиоактивное мечение очень чувствительно и оптимально для визуализации небольших количеств ДНК. Флуоресценция является желательным достижением из-за опасности использования радиохимических веществ. Однако его было сложнее оптимизировать, поскольку он не всегда достаточно чувствителен для обнаружения низких концентраций целевых цепей ДНК, используемых в экспериментах по отслеживанию ДНК. Гели для электрофоретического секвенирования или капиллярный электрофорез оказались успешными при анализе следов флуоресцентно-меченных фрагментов. [2]
Агент расщепления
[ редактировать ]Могут быть выбраны различные расщепляющие агенты. желательным агентом является агент, нейтральный по последовательности, простой в использовании и легко контролируемый. К сожалению, ни один из доступных агентов не соответствует всем этим стандартам, поэтому подходящий агент можно выбрать в зависимости от вашей последовательности ДНК и интересующего лиганда. Подробно описаны следующие расщепляющие агенты: ДНКаза I представляет собой крупный белок, функционирующий как двухцепочечная эндонуклеаза . Он связывает малую бороздку ДНК и расщепляет фосфодиэфирный остов. Это хороший агент для расщепления следов, поскольку из-за его размера его легко физически затруднить. Таким образом, с большей вероятностью его действие будет заблокировано связанным белком в последовательности ДНК. Кроме того, фермент ДНКаза I легко контролировать путем добавления ЭДТА для остановки реакции. Однако есть некоторые ограничения в использовании ДНКазы I. Фермент не разрезает ДНК случайным образом; на его активность влияют локальная структура и последовательность ДНК, и поэтому лестница получается неравномерной. Это может ограничить точность предсказания места связывания белка на молекуле ДНК. [2] [3] Гидроксильные радикалы образуются в результате реакции Фентона , которая включает восстановление Fe 2+ с H 2 O 2 с образованием свободных гидроксильных молекул. Эти гидроксильные молекулы реагируют с основной цепью ДНК, что приводит к разрыву. Благодаря небольшому размеру полученный след ДНК имеет высокое разрешение. В отличие от ДНКазы I, они не зависят от последовательности и приводят к гораздо более равномерному распределению лестницы. Отрицательным аспектом использования гидроксильных радикалов является то, что их использование требует больше времени из-за более медленной реакции и времени переваривания. [4] Ультрафиолетовое облучение можно использовать для возбуждения нуклеиновых кислот и создания фотореакций, которые приводят к повреждению оснований в цепи ДНК. [5] Фотореакции могут включать: разрывы одной цепи, взаимодействия между нитями ДНК или внутри них, реакции с растворителями или сшивки с белками. Рабочий процесс этого метода включает дополнительный этап: после обработки как защищенной, так и незащищенной ДНК происходит последующее удлинение праймеров расщепленных продуктов. [6] [7] Расширение прекращается при достижении поврежденного основания и, следовательно, когда продукты ПЦР прогоняются бок о бок на геле; защищенный образец покажет дополнительную полосу, где ДНК была сшита со связанным белком. Преимущества использования УФ заключаются в том, что он реагирует очень быстро и, следовательно, может фиксировать лишь кратковременные взаимодействия. Кроме того, его можно применять в экспериментах in vivo , поскольку ультрафиолет может проникать через клеточные мембраны. Недостатком является то, что гель может быть трудно интерпретировать, поскольку связанный белок не защищает ДНК, а просто изменяет фотореакции поблизости. [8]
Расширенные приложения
[ редактировать ]in vivo Следы
[ редактировать ]In vivo footprinting — это метод, используемый для анализа взаимодействий белок-ДНК, которые происходят в клетке в определенный момент времени. [9] [10] ДНКазу I можно использовать в качестве агента расщепления, если клеточная мембрана проницаема. Однако наиболее распространенным агентом расщепления является УФ-облучение, поскольку оно проникает через клеточную мембрану, не нарушая состояния клетки, и, таким образом, может захватывать взаимодействия, чувствительные к клеточным изменениям. После того как ДНК расщеплена или повреждена УФ-излучением, клетки можно лизировать и очистить ДНК для анализа интересующей области. ПЦР с лигированием является альтернативным методом исследования in vivo . После того, как к геномной ДНК был применен агент расщепления, что привело к одноцепочечным разрывам, и ДНК была выделена, к точкам разрыва добавляется линкер. Область интереса амплифицируется между линкером и ген-специфическим праймером, и при работе на полиакриламидном геле будет оставаться след, где был связан белок. [11] In vivo следы в сочетании с иммунопреципитацией можно использовать для оценки специфичности белка во многих местах генома. ДНК, связанная с интересующим белком, может быть иммунопреципитирована с помощью антитела к этому белку, а затем можно оценить связывание специфической области с использованием метода ДНК-следа. [12]
Количественный след
[ редактировать ]Методику ДНК-следа можно модифицировать для оценки силы связывания белка с участком ДНК. Используя различные концентрации белка для эксперимента по отслеживанию следов, можно наблюдать появление следа по мере увеличения концентрации, а затем можно оценить аффинность связывания белков. [2]
Обнаружение методом капиллярного электрофореза
[ редактировать ]Чтобы адаптировать технику следа к обновленным методам обнаружения, меченые фрагменты ДНК обнаруживаются с помощью устройства капиллярного электрофореза, а не на полиакриламидном геле. Если анализируемый фрагмент ДНК получен с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), к праймерам легко присоединить флуоресцентную молекулу, такую как карбоксифлуоресцеин (FAM). Таким образом, фрагменты, полученные в результате расщепления ДНКазой I, будут содержать FAM и будут обнаруживаться с помощью аппарата капиллярного электрофореза. Обычно к смеси анализируемых фрагментов также добавляют стандарты размера, меченные карбокситетраметилродамином (ROX). Таким образом были успешно идентифицированы сайты связывания транскрипционных факторов. [13]
Полногеномные анализы
[ редактировать ]Секвенирование нового поколения позволило использовать полногеномный подход для идентификации следов ДНК. Анализы открытого хроматина, такие как DNase-Seq [14] и FAIRE-Seq [15] доказали, что они обеспечивают надежную нормативную базу для многих типов клеток. [16] Однако эти анализы требуют некоторых последующих биоинформатических анализов, чтобы выявить следы ДНК по всему геному. Предлагаемые вычислительные инструменты можно разделить на два класса: подходы на основе сегментации и сайтоцентрические подходы.
Методы, основанные на сегментации, основаны на применении скрытых марковских моделей или методов скользящего окна для сегментации генома на открытую/закрытую область хроматина. Примерами таких методов являются: HINT, [17] метод Бойля [18] и метод Нефа. [19] Сайт-центрические методы, с другой стороны, находят следы с учетом открытого профиля хроматина вокруг сайтов связывания, предсказанных мотивом, т.е. регуляторных областей, предсказанных с использованием информации о последовательности ДНК-белка (закодированной в таких структурах, как матрица весов позиций ). Примеры этих методов: СОРОКНОДКА. [20] и метод Куэльяра-Партиды. [21]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Галас, Д; Шмитц, А (1978). «Отпечаток ДНКазы: простой метод определения специфичности связывания белок-ДНК» . Исследования нуклеиновых кислот . 5 (9): 3157–70. дои : 10.1093/нар/5.9.3157 . ПМЦ 342238 . ПМИД 212715 .
- ^ Jump up to: а б с д Хэмпшир, А; Руслинг, Д; Бротон-Хед, В.; Фокс, К. (2007). «Следование: метод определения селективности последовательности, сродства и кинетики ДНК-связывающих лигандов». Методы . 42 (2): 128–140. дои : 10.1016/j.ymeth.2007.01.002 . ПМИД 17472895 .
- ^ ЛеБлан Б. и Мосс Т. (2001) След ДНКазы I. Методы молекулярной биологии. 148: 31–8.
- ^ Зайчиков Е., Шикор П., Денисова Л. и Хойманн Х. (2001) Следы гидроксильных радикалов. Методы молекулярной биологии. 148: 49–61.
- ^ Беккер, ММ; Ван, JC (1984). «Использование света для отслеживания ДНК in vivo». Природа . 309 (5970): 682–687. Бибкод : 1984Natur.309..682B . дои : 10.1038/309682a0 . ПМИД 6728031 . S2CID 31638231 .
- ^ Аксельрод, доктор юридических наук; Мейджорс, Дж (1989). «Улучшенный метод фотопринтинга дрожжевых генов in vivo с использованием Taq-полимеразы» . Нуклеиновые кислоты Рез . 17 (1): 171–183. дои : 10.1093/NAR/17.1.171 . ПМЦ 331543 . ПМИД 2643080 .
- ^ Беккер, ММ; Ван, З.; Гроссманн, Г.; Бехерер, К.А. (1989). «Геномный след в клетках млекопитающих с помощью ультрафиолетового света» . ПНАС . 86 (14): 5315–5319. Бибкод : 1989PNAS...86.5315B . дои : 10.1073/PNAS.86.14.5315 . ПМК 297612 . ПМИД 2748587 .
- ^ Гейзельманн Дж. и Боккар Ф. (2001) Ультрафиолетовый лазерный след. Методы молекулярной биологии. 148:161-73.
- ^ Беккер, ММ; Ван, JC (1984). «Использование света для отслеживания ДНК in vivo». Природа . 309 (5970): 682–687. Бибкод : 1984Natur.309..682B . дои : 10.1038/309682a0 . ПМИД 6728031 . S2CID 31638231 .
- ^ Эфрусси, А.; Черч, генеральный директор; Тонегава, С.; Гилберт, В. (1985). «Взаимодействие усилителя иммуноглобулина с клеточными факторами in vivo, специфичное для линии B». Наука . 227 (4683): 134–140. Бибкод : 1985Sci...227..134E . дои : 10.1126/science.3917574 . ПМИД 3917574 .
- ^ Дай С., Чен Х., Чанг С., Риггс А., Фланаган С. (2000)ПЦР, опосредованная лигированием, для количественного определения следов in vivo. Природная биотехнология. 18:1108–1111.
- ^ Зарет, К. (1997). «Редакция». Методы . 11 (2): 149–150. дои : 10.1006/meth.1996.0400 . ПМИД 8993026 .
- ^ Ковач, Кристиан А.; Штайнманн, Мириам; Маджистретти, Пьер Ж.; Халфон, Оливье; Кардино, Жан-Рене (2006). «C / EBPβ связывает передачу сигналов дофамина с экспрессией гена-предшественника вещества P в нейронах полосатого тела». Журнал нейрохимии . 98 (5): 1390–1399. дои : 10.1111/j.1471-4159.2006.03957.x . ПМИД 16771829 . S2CID 36225447 .
- ^ Песня, Л; Кроуфорд, GE (февраль 2010 г.). «DNase-seq: метод высокого разрешения для картирования активных генных регуляторных элементов по всему геному клеток млекопитающих» . Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2010 (2): pdb.prot5384+. дои : 10.1101/pdb.prot5384 . ПМЦ 3627383 . ПМИД 20150147 .
- ^ Гиреси, П.Г.; Ким, Дж; МакДэниел, Р.М.; Айер, ВР; Либ, JD (июнь 2007 г.). «FAIRE (выделение регуляторных элементов с помощью формальдегида) изолирует активные регуляторные элементы из хроматина человека» . Геномные исследования . 17 (6): 877–85. дои : 10.1101/гр.5533506 . ЧВК 1891346 . ПМИД 17179217 .
- ^ Турман, Р.Э.; и др. (сентябрь 2012 г.). «Доступный хроматиновый ландшафт человеческого генома» . Природа . 489 (7414): 75–82. Бибкод : 2012Natur.489...75T . дои : 10.1038/nature11232 . ПМЦ 3721348 . ПМИД 22955617 .
- ^ Гусмао, Е.Г.; Дитрих, К; Зенке, М; Коста, И.Г. (август 2014 г.). «Обнаружение сайтов связывания активных транскрипционных факторов с сочетанием гиперчувствительности ДНКазы и модификаций гистонов» . Биоинформатика . 30 (22): 3143–51. doi : 10.1093/биоинформатика/btu519 . ПМИД 25086003 .
- ^ Бойл, AP; и др. (март 2011 г.). «Полногеномное отслеживание in vivo различных факторов транскрипции в клетках человека» . Геномные исследования . 21 (3): 456–464. дои : 10.1101/гр.112656.110 . ПМК 3044859 . ПМИД 21106903 .
- ^ Неф, С; и др. (сентябрь 2012 г.). «Обширный регуляторный лексикон человека, закодированный в следах факторов транскрипции» . Природа . 489 (7414): 83–90. Бибкод : 2012Natur.489...83N . дои : 10.1038/nature11212 . ПМЦ 3736582 . ПМИД 22955618 .
- ^ Пике-Режи, Р; и др. (март 2011 г.). «Точный вывод о связывании фактора транскрипции на основе данных о последовательности ДНК и доступности хроматина» . Геномные исследования . 21 (3): 447–455. дои : 10.1101/гр.112623.110 . ПМК 3044858 . ПМИД 21106904 .
- ^ Куэльяр-Партида, Ж; и др. (январь 2012 г.). «Эпигенетические априорные методы определения сайтов связывания активных факторов транскрипции» . Биоинформатика . 28 (1): 56–62. doi : 10.1093/биоинформатика/btr614 . ПМЦ 3244768 . ПМИД 22072382 .