Биокирпич
BioBrick Части представляют собой последовательности ДНК , соответствующие стандарту сборки ферментов рестрикции . [1] [2] Эти строительные блоки используются для проектирования и сборки более крупных синтетических биологических схем из отдельных частей и комбинаций частей с определенными функциями, которые затем будут включены в живые клетки, такие как клетки Escherichia coli, для создания новых биологических систем. [3] Примеры частей BioBrick включают промоторы , сайты связывания рибосом (RBS) , кодирующие последовательности и терминаторы .
Обзор
[ редактировать ]
Детали BioBrick используются с применением инженерных принципов абстракции и модульности. Части BioBrick составляют основу иерархической системы, на которой синтетическая биология основана . В иерархии есть три уровня:
- Части: фрагменты ДНК, образующие функциональную единицу (например, промотор, RBS и т. д.).
- Устройство: Набор деталей с определенной функцией. Проще говоря, набор взаимодополняющих частей BioBrick, собранных вместе, образует устройство.
- Система: сочетание набора устройств, выполняющих задачи высокого уровня.
Разработка стандартизированных биологических частей позволяет быстро собирать последовательности. Возможность тестирования отдельных частей и устройств для независимого тестирования и характеристики также повышает надежность систем более высокого порядка. [2]
История
[ редактировать ]Первая попытка создать список стандартных биологических частей была предпринята Ребатчуком и др . в 1996 году. Эта команда представила стратегию клонирования для сборки коротких фрагментов ДНК. Однако эта ранняя попытка не получила широкого признания в научно-исследовательском сообществе того времени. [2] [4] В 1999 году Аркин и Энди поняли, что гетерогенным элементам, составляющим генетическую схему, не хватает стандартов, поэтому они предложили список стандартных биологических частей. [5] BioBricks были описаны и представлены Томом Найтом из Массачусетского технологического института в 2003 году. [1] С тех пор различные исследовательские группы использовали стандартные детали BioBrick для разработки новых биологических устройств и систем.
Фонд Биокирпичей
[ редактировать ]Фонд BioBricks Foundation был основан в 2006 году инженерами и учеными как некоммерческая организация для стандартизации биологических частей во всех областях. [6] Фонд фокусируется на совершенствовании в областях технологий, права, образования и глобального сообщества применительно к синтетической биологии . Деятельность BioBricks Foundation включает проведение конференций SBx.0, технических и образовательных программ. Конференции SBx.0 — это международные конференции по синтетической биологии, проводимые по всему миру. Технические программы направлены на производство ряда стандартных биологических частей, а расширение их образования заключается в создании актов, которые помогают создавать открытые стандартизированные источники биологических частей. [7]
Публичное соглашение BioBricks
[ редактировать ]В качестве альтернативы традиционным патентным системам в области биотехнологий и стремясь позволить использовать BioBricks в качестве стандарта сообщества с открытым исходным кодом, Фонд BioBricks создал Публичное соглашение BioBrick, которое состоит из Соглашения участника и Пользовательского соглашения. Те, кто хочет передать свою часть сообществу, подписывают Соглашение с автором, соглашаясь не предъявлять к пользователям права интеллектуальной собственности, принадлежащие автору, которые могут ограничить использование предоставленных материалов. Подписавшие Пользовательское соглашение могут свободно использовать всю коллекцию частей, предоставленную участниками. От пользователей не требуется вносить вклад в сообщество, чтобы использовать части, и пользователи могут заявлять права интеллектуальной собственности на изобретения, разработанные с использованием частей. [8] Пользовательское соглашение позволяет пользователям изобретать способы использования деталей, раскрывать патенты на комбинации деталей и свободно использовать вклад других пользователей. [9] [10]
Стандарт сборки BioBrick
[ редактировать ]Стандарт сборки BioBrick был введен, чтобы преодолеть недостаток стандартизации, связанный с традиционными методами молекулярного клонирования . Стандарт сборки BioBrick — это более надежный подход к объединению деталей в более крупные композиты. Стандарт сборки позволяет двум группам синтетических биологов в разных частях мира повторно использовать деталь BioBrick, не проходя весь цикл проектирования и манипуляций. [2] Это означает, что недавно разработанную деталь будет легче использовать другим группам исследователей. Кроме того, по сравнению со старомодным методом специального клонирования, стандартный процесс сборки происходит быстрее и способствует автоматизации. [11] Стандарт сборки BioBrick 10 был первым введенным стандартом сборки. За прошедшие годы было разработано несколько других стандартов сборки, таких как стандарт Biofusion и стандарт Фрайбурга.
Стандарт сборки BioBrick 10
[ редактировать ]
Стандарт сборки 10 был разработан Томом Найтом и является наиболее широко используемым стандартом сборки. Он предполагает использование ферментов рестрикции . Каждая часть BioBrick представляет собой последовательность ДНК, переносимую кольцевой плазмидой , действующей как вектор . [12] Вектор действует как транспортная система для перевозки частей BioBrick. Первым подходом к стандарту BioBrick было введение стандартных последовательностей, префиксных и суффиксных последовательностей, которые фланкируют 5'- и 3' - концы части ДНК соответственно. [13] Эти стандартные последовательности кодируют определенные сайты ферментов рестрикции. Префиксная последовательность кодирует сайты EcoRI (E) и Xbal (X), тогда как суффиксная последовательность кодирует сайты SpeI (S) и PstI (P). Префикс и суффикс не считаются частью BioBrick. [3] Чтобы облегчить процесс сборки, сама деталь BioBrick не должна содержать ни одного из этих сайтов рестрикции. Во время сборки двух разных частей одна из плазмид расщепляется EcoRI и SpeI . Плазмиду, несущую другую часть BioBrick, расщепляют EcoRI и Xbal . В результате обе плазмиды имеют выступающие части из 4 пар оснований (bp) на 5'- и 3' - концах. Сайты EcoRI будут лигироваться, поскольку они дополняют друг друга. Сайты Xbal и SpeI также будут лигироваться, поскольку в результате расщепления образуются совместимые концы. Теперь обе части ДНК находятся в одной плазмиде. В результате лигирования образуется «рубцовый» участок из 8 пар оснований между двумя частями BioBrick. Поскольку сайт рубца представляет собой гибрид сайтов Xbal и SpeI , он не распознается ни одним из ферментов рестрикции. [13] Последовательности префикса и суффикса остаются неизменными в процессе расщепления и лигирования, что позволяет выполнять последующие этапы сборки с использованием большего количества деталей BioBrick.
Эта сборка представляет собой идемпотентный процесс: несколько приложений не меняют конечный продукт и сохраняют префикс и суффикс. Хотя стандартная сборка BioBrick позволяет формировать функциональные модули, этот стандартный подход имеет ограничение. Рубцовый участок размером 8 п.н. не позволяет создать гибридный белок . [12] Участок рубца вызывает сдвиг рамки , который предотвращает непрерывное считывание кодонов, необходимое для образования слитого белка.
Позже Том Найт разработал стандарт сборки BB-2 в 2008 году для решения проблем с соединением рубцов белковых доменов и того, что рубцы состоят из восьми оснований, что приводит к измененной рамке считывания при соединении белковых доменов. Ферменты, используемые для переваривания исходных частей, почти те же, но с измененными приставками и суффиксами. [14]
Стандарт сборки BglBricks
[ редактировать ]Стандарт сборки BglBrick был предложен Дж. Кристофером Андерсоном, Джоном Э. Дубером, Марианой Легия, Габриэлем К. Ву, Джонатаном К. Голером, Адамом П. Аркином и Джеем Д. Кислингом в сентябре 2009 года как стандарт, очень похожий по концепции. к BioBrick, но позволяющий генерировать слитые белки без изменения рамки считывания или введения стоп-кодонов и при этом создавая относительно нейтральный аминокислотный линкерный рубец (GlySer). Часть BglBrick представляет собой последовательность ДНК, фланкированную 5' - сайтами EcoRI и BglII (GAATTCaaaA GATCT ) и 3' - сайтами BamHI и XhoI ( G GATCCaaaCTCGAG), и лишенная этих же сайтов рестрикции внутри. Вышестоящую часть парной сборки очищают от гидролизата EcoRI/BamHI, а нижестоящую часть + вектор очищают от гидролизата EcoRI/BglII. Лигирование этих двух фрагментов создает составную часть, преобразующую исходные фланкирующие сайты, необходимые для определения части, и оставляющую рубцовую последовательность GGATCT на стыке частей, рубец, который кодирует аминокислоты глицин и серин при слиянии частей CDS вместе в рамке считывания. , что удобно, поскольку дипептид GlySer является популярным линкером белковых доменов. [2]
Серебряный (биофузионный) стандарт
[ редактировать ]
Лаборатория Пэм Сильвер создала стандарт сборки Silver, чтобы решить проблему, связанную с образованием гибридного белка. Этот стандарт сборки также известен как стандарт Biofusion и является улучшением стандарта сборки BioBrick 10. Стандарт Сильвера включает удаление одного нуклеотида из сайтов Xbal и SpeI , что укорачивает участок рубца на 2 нуклеотида, что теперь образует 6 п.о. последовательность рубцов. Последовательность из 6 пар оснований позволяет сохранять рамку считывания. Последовательность рубца кодирует аминокислоты треонин (ACT) и аргинин (AGA). [15] Это незначительное улучшение позволяет образовывать слитый белок внутри рамки. Однако тот факт, что аргинин является большой заряженной аминокислотой, является недостатком метода сборки биослияния: эти свойства аргинина приводят к дестабилизации белка по правилу N-конца .
Фрайбургский стандарт
[ редактировать ]Команда Freiburg iGEM 2007 г. [16] представила новый стандарт сборки, чтобы преодолеть недостатки существующей стандартной технологии биослияния. Команда из Фрайбурга создала новый набор префиксных и суффиксных последовательностей, введя дополнительные сайты ферментов рестрикции AgeI и NgoMIV к существующим префиксу и суффиксу соответственно. Эти недавно введенные сайты рестрикционных ферментов совместимы со стандартами BioBrick. Фрайбургский стандарт по-прежнему образует участок рубца длиной 6 пар оснований, но последовательность рубца (ACCGGC) теперь кодирует треонин и глицин соответственно. Эта последовательность рубцов приводит к образованию гораздо более стабильного белка. [17] поскольку глицин образует стабильный N-конец, в отличие от аргинина, который сигнализирует о деградации N-конца. Техника сборки, предложенная командой из Фрайбурга, уменьшает ограничения стандарта Biofusion.
Метод сборки
[ редактировать ]При сборке BioBricks используются разные методы. Это связано с тем, что некоторые стандарты требуют разных материалов и методов (использование разных ферментов рестрикции), тогда как другие обусловлены предпочтениями в протоколе, поскольку некоторые методы сборки имеют более высокую эффективность и удобны для пользователя.
3 Сборка антибиотика (3А)
[ редактировать ]Метод сборки 3A является наиболее часто используемым, поскольку он совместим со стандартом сборки 10, серебряным стандартом, а также со стандартом Фрайбурга. Этот метод сборки включает в себя две части BioBrick и целевую плазмиду. Плазмида назначения содержит токсичный (летальный) ген, что облегчает выбор правильно собранной плазмиды. Плазмиды назначения также имеют гены устойчивости к антибиотикам, отличные от плазмид, несущих части BioBrick. Все три плазмиды расщепляются соответствующим ферментом рестрикции, а затем подвергаются лигированию. Только правильно собранная часть даст жизнеспособную составную часть, содержащуюся в целевой плазмиде. Это обеспечивает хороший выбор, поскольку выживают только правильно собранные детали BioBrick.
Усиленная вставка в сборе
[ редактировать ]Метод сборки амплифицированной вставки не зависит от последовательностей префиксов и суффиксов, что позволяет использовать его в сочетании с большинством стандартов сборки. Он также имеет более высокую скорость трансформации, чем сборка 3А, и не требует, чтобы участвующие плазмиды имели разные гены устойчивости к антибиотикам. Этот метод снижает шум от неразрезанных плазмид за счет амплификации желаемой вставки с помощью ПЦР перед расщеплением и обработки смеси ферментом рестрикции DpnI, который расщепляет метилированную ДНК, как и плазмиды. При удалении матричных плазмид с помощью DpnI остается только вставка, подлежащая амплификации с помощью ПЦР. Чтобы уменьшить возможностьсоздавая плазмиды с нежелательными комбинациями вставки и основной цепи, основную цепь можно обработать фосфатазой, чтобы предотвратить ее повторное лигирование. [14]
Сборка Гибсона без шрамов
[ редактировать ]Метод сборки без рубцов Гибсона позволяет одновременно соединять несколько BioBricks. Этот метод требует, чтобы желаемые последовательности имели перекрытие от 20 до 150 bps . Поскольку у BioBricks такого перекрытия нет, этот метод требует, чтобы праймеры для ПЦР создавали выступы между соседними BioBricks. Экзонуклеаза Т5 атакует 5' - концы последовательностей, создавая одноцепочечную ДНК на концах всех последовательностей, где различные компоненты предназначены для отжига. Затем ДНК-полимераза добавляет части ДНК к пробелам в компонентах отжига, а Taq-лигаза может запечатать конечные цепи. [14]
Сборка с помощью метилазы (4R/2M)
[ редактировать ]Метод сборки 4R/2M был разработан для объединения частей (стандарт сборки BioBrick 10 или стандарт серебра) внутри существующих плазмид (т.е. без ПЦР или субклонирования). Плазмиды реагируют in vivo с специфичными для последовательности ДНК-метилтрансферазами, так что каждая из них модифицируется и защищается от одной из двух эндонуклеаз рестрикции, которые позже используются для линеаризации нежелательных продуктов кольцевого лигирования. [18]
Реестр запчастей
[ редактировать ]Группа Массачусетского технологического института во главе с Томом Найтом, которая разработала конкурс BioBricks и International Genetically Engineered Machines (iGEM), также является пионером Реестра стандартных биологических частей (Registry). [19] Реестр, являющийся одной из основ синтетической биологии, предоставляет в Интернете информацию и данные о более чем 20 000 частях BioBrick. Реестр содержит:
- Информация и характеристики всех частей, устройств и систем.
- Включает каталог, в котором описаны функции, характеристики и конструкция каждой детали.
Каждая часть BioBrick имеет свой уникальный идентификационный код, который упрощает поиск нужной части BioBrick (например, BBa_J23100, конститутивный промотор). [2] Реестр имеет открытый доступ, поэтому любой может отправить часть BioBrick. Большая часть заявок BioBrick поступает от студентов, участвующих в ежегодном конкурсе iGEM, который проводится каждое лето. [20] Реестр позволяет обмениваться данными и материалами в режиме онлайн, что позволяет быстро повторно использовать и модифицировать части участвующим сообществом.
Также были разработаны профессиональные реестры запчастей. Поскольку большинство деталей BioBrick представлены студентами в рамках конкурса iGEM, в деталях могут отсутствовать важные данные о характеристиках и метаданные, которые будут необходимы, когда дело доходит до проектирования и моделирования функциональных компонентов. [19] Одним из примеров профессионального реестра частей является базирующаяся в США финансируемая государством организация The International Open Facility Advance Biotechnology (BIOFAB), которая содержит подробные описания каждой биологической части. Это также реестр с открытым исходным кодом, который доступен на коммерческой основе. BIOFAB стремится каталогизировать высококачественные детали BioBrick для удовлетворения потребностей профессионального сообщества синтетической биологии.
Фонд BioBrick Foundation (BBF) — это общественно-полезная организация, созданная для содействия использованию стандартизированных деталей BioBrick в масштабах, выходящих за рамки конкуренции iGEM. В настоящее время BBF работает над созданием стандартной структуры для продвижения производства высококачественных деталей BioBrick, которые будут свободно доступны каждому. [21]
См. также
[ редактировать ]Внешние ссылки
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Найт, Томас (2003). «Идемпотентный векторный дизайн для стандартной сборки биокирпичей» . hdl : 1721.1/21168 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж Найт, Томас Ф; Решма П. Шетти; Дрю Энди (14 апреля 2008 г.). «Инжиниринг векторов BioBrick из частей BioBrick» . Журнал биологической инженерии . 2 (5): 5. дои : 10.1186/1754-1611-2-5 . ISSN 1754-1611 . ПМК 2373286 . ПМИД 18410688 .
- ^ Jump up to: а б «Стандарты SynBio -BioBrick» (PDF) . Архивировано из оригинала (PDF) 27 марта 2014 года . Проверено 27 марта 2014 г.
- ^ Ребачук, Дмитрий; Дараселия, Н.; Нарита, ДЖО (1 октября 1996 г.). «NOMAD: универсальная стратегия манипуляций с ДНК in vitro, применяемая для анализа промоторов и дизайна векторов» . Труды Национальной академии наук . 93 (20): 10891–10896. Бибкод : 1996PNAS...9310891R . дои : 10.1073/pnas.93.20.10891 . ПМЦ 38253 . ПМИД 8855278 .
- ^ Аркин, Адам. «Стандартный список деталей для биологических схем» (PDF) . Проверено 27 марта 2014 г.
- ^ «О компании — Фонд BioBricks» . Фонд BioBricks . Архивировано из оригинала 13 ноября 2015 г. Проверено 4 ноября 2015 г.
- ^ «Программы — BioBricks Foundation» . Фонд BioBricks . Архивировано из оригинала 17 сентября 2015 г. Проверено 4 ноября 2015 г.
- ^ «Часто задаваемые вопросы | Фонд BioBricks» . Проверено 19 октября 2021 г.
- ^ Марк, Фишер; Ли, Крюс; Дженнифер, Линч; Джейсон, Шульц; Дэвид, Гревал; Дрю, Энди (18 октября 2009 г.). «Публичное соглашение BioBrick v1 (проект)». hdl : 1721.1/49434 .
{{cite journal}}: Для цитирования журнала требуется|journal=( помощь ) - ^ Смолке, Кристина Д (2009). «Строительство нестандартно: iGEM и Фонд BioBricks». Природная биотехнология . 27 (12): 1099–1102. дои : 10.1038/nbt1209-1099 . ПМИД 20010584 . S2CID 5486814 .
- ^ «Подход BioBrick» . j5.jbei.org .
- ^ Jump up to: а б Слейт, Южная Каролина; Бартли, бакалавр; Ливиант, Дж. А.; Сауро, Ее Величество (12 апреля 2010 г.). «Сборка и реинжиниринг In-Fusion BioBrick» . Исследования нуклеиновых кислот . 38 (8): 2624–2636. дои : 10.1093/nar/gkq179 . ПМК 2860134 . ПМИД 20385581 .
- ^ Jump up to: а б Шетти, Р.; Лизаразо, М.; Реттберг, Р.; Найт, ТФ (2011). Сборка стандартных биологических частей BioBrick с использованием сборки из трех антибиотиков . Методы энзимологии. Том. 498. стр. 311–26. дои : 10.1016/B978-0-12-385120-8.00013-9 . hdl : 1721.1/65066 . ISBN 9780123851208 . ПМИД 21601683 .
- ^ Jump up to: а б с Рёкке, Г.; Корвальд, Э.; Пар, Дж.; Ойос, О.; Лале, Р. (1 января 2014 г.). Валла, Свейн; Лале, Рахми (ред.). Стандарты и методы сборки BioBrick и сопутствующие программные инструменты . Методы молекулярной биологии. Том. 1116. Хумана Пресс. стр. 1–24. дои : 10.1007/978-1-62703-764-8_1 . ISBN 978-1-62703-763-1 . ПМИД 24395353 .
- ^ Сильвер, Памела А.; Ира Э. Филлипс (18 апреля 2006 г.). «Новая стратегия сборки биокирпичиков, разработанная для упрощенной белковой инженерии» (PDF) . Гарвардская медицинская школа : 1–6.
- ^ «Freiburg07/report fusion parts — 2007.igem.org» . 29 августа 2021 г. Архивировано из оригинала 29 августа 2021 г.
- ^ Мюллер, Кристиан М. «dspace.mit.edu/bitstream/handle/1721.1/45140/BBF_RFC%2025.pdf?sequence=1» (PDF) . Массачусетский технологический институт . Проверено 27 марта 2014 г.
- ^ Мацумура И. 2020. Субклонирование с помощью метилазы для высокопроизводительной сборки BioBrick. PeerJ 8:e9841 https://doi.org/10.7717/peerj.9841
- ^ Jump up to: а б Болдуин, Джефф (2012). Букварь Синтетическая биология . . Лондон: Имперский колледж Pr. ISBN 978-1848168633 .
- ^ «Главная страница — ung.igem.org» . igem.org . Проверено 10 ноября 2015 г.
- ^ «О Фонде BioBricks» . Архивировано из оригинала 13 ноября 2015 года . Проверено 27 марта 2014 г.