Секвенирование транспозонов
 | В этой статье есть несколько проблем. Пожалуйста, помогите улучшить его или обсудите эти проблемы на странице обсуждения . ( Узнайте, как и когда удалять эти сообщения )
|
Секвенирование вставки транспозонов ( Tn-seq ) сочетает в себе инсерционный мутагенез транспозонов с массово-параллельным секвенированием (MPS) сайтов вставки транспозонов для идентификации генов, способствующих интересующей функции у бактерий . Первоначально метод был разработан в результате одновременной работы в четырех лабораториях под аббревиатурами HITS, [ 1 ] ИНСек, [ 2 ] Традис [ 3 ] и Tn-Seq. [ 4 ] Впоследствии были разработаны многочисленные вариации, которые были применены к различным биологическим системам. В совокупности эти методы часто называют Tn-Seq, поскольку все они включают мониторинг пригодности мутантов вставки транспозонов с помощью подходов секвенирования ДНК. [ 5 ]
Транспозоны представляют собой строго регулируемые дискретные сегменты ДНК , которые могут перемещаться внутри генома. Они универсальны и встречаются у эубактерий , архей и эукариев , включая человека. Транспозоны оказывают большое влияние на экспрессию генов и могут использоваться для определения функции генов. Фактически, когда транспозон встраивается в ген, функция гена нарушается. [ 6 ] Из-за этого свойства транспозоны стали использоваться для инсерционного мутагенеза. [ 7 ] Развитие секвенирования микробного генома стало большим достижением в использовании мутагенеза транспозонов. [ 8 ] [ 9 ] Функция, на которую влияет вставка транспозона, может быть связана с разрушенным геном путем секвенирования генома для определения места вставки транспозона. Массивно-параллельное секвенирование позволяет одновременно секвенировать сайты вставки транспозонов в больших смесях различных мутантов. Следовательно, полногеномный анализ возможен, если транспозоны расположены по всему геному в коллекции мутантов. [ 5 ]
Секвенирование транспозонов требует создания библиотеки вставок транспозонов, которая будет содержать группу мутантов, которые в совокупности имеют вставки транспозонов во всех несущественных генах. Библиотека выращивается в экспериментальных условиях, представляющих интерес. Частота появления мутантов с транспозонами, встроенными в гены, необходимые для роста в условиях тестирования, будет уменьшаться в популяции. Чтобы идентифицировать утраченные мутанты, геномные последовательности, прилегающие к концам транспозонов, амплифицируются с помощью ПЦР и секвенируются с помощью MPS для определения местоположения и распространенности каждой инсерционной мутации. Важность каждого гена для роста в тестируемых условиях определяют путем сравнения численности каждого мутанта до и после роста в исследуемых условиях. Tn-seq полезен как для изучения приспособленности отдельного гена, так и для изучения взаимодействия генов. [ 10 ]
Мутагенез с сигнатурными метками (STM) — это более старый метод, который также включает объединение мутантов по вставке транспозонов для определения важности разрушенных генов в условиях селективного роста. [ 11 ] В высокопроизводительных версиях СТМ используются геномные микрочипы, которые менее точны и имеют меньший динамический диапазон, чем массово-параллельное секвенирование. [ 5 ] С изобретением секвенирования нового поколения геномные данные стали все более доступными. Однако, несмотря на увеличение геномных данных, наши знания о функции генов остаются ограничивающим фактором в нашем понимании роли, которую играют гены. [ 12 ] [ 13 ] Следовательно, возникла необходимость в высокопроизводительном подходе для изучения отношений генотип-фенотип, таком как Tn-seq.
Методология
[ редактировать ]Секвенирование транспозонов начинается с преобразования [ нужны разъяснения ] бактериальные популяции с мобильными элементами [ нужны разъяснения ] с помощью бактериофагов . Tn-сек. [ нужны разъяснения ] использует транспозон Himar I Mariner, распространенный и стабильный [ нужны разъяснения ] транспозон. После трансдукции ДНК расщепляется [ нужны разъяснения ] и вставленную последовательность амплифицировали с помощью ПЦР . Сайты признания [ нужны разъяснения ] для MmeI, эндонуклеазы рестрикции типа IIS [ нужны разъяснения ] может быть введен путем замены одного нуклеотида в концевых повторах. [ нужны разъяснения ] Маринера [ нужны разъяснения ] . [ 14 ] Это [ нужны разъяснения ] расположен за 4 пары оснований до конца терминального повтора.
MmeI разрезает 2 пары оснований в шахматном порядке. [ нужны разъяснения ] 20 баз ниже по течению [ нужны разъяснения ] сайта узнавания [ нужны разъяснения ] . [ 15 ]
Когда MmeI переваривает ДНК из библиотеки [ нужны разъяснения ] мутантов по инсерции транспозонов [ нужны разъяснения ] образуется фрагментированная ДНК, включающая левый и правый транспозон и 16 пар оснований окружающей геномной ДНК. Фрагмента из 16 пар оснований достаточно, чтобы определить место вставки транспозона в бактериальный геном. Перевязка [ нужны разъяснения ] адаптера [ нужны разъяснения ] этому способствует 2-х базовый свес [ нужны разъяснения ] . Сначала [ нужны разъяснения ] специфичный для адаптера и праймер, специфичный для транспозона, используются для амплификации последовательности посредством ПЦР. Продукт из 120 пар оснований [ нужны разъяснения ] затем выделяют с использованием агарозного геля [ нужны разъяснения ] или СТРАНИЦА [ нужны разъяснения ] очищение. Затем используется массовое параллельное секвенирование для определения последовательностей фланкирующих 16 пар оснований. [ нужны разъяснения ] . [ 10 ]
Функция гена определяется после изучения влияния вставки на функцию гена при определенных условиях. [ нужны разъяснения ] .
Преимущества и недостатки
[ редактировать ]В отличие от высокопроизводительного отслеживания вставки путем глубокого секвенирования (HITS) и транспозон-направленного секвенирования сайта вставки (TraDIS) [ нужны разъяснения ] Tn-seq специфичен для транспозона Himar I Mariner и не может быть применен к другим транспозонам или инсерционным элементам. [ 10 ] Однако протокол Tn-seq [ нужны разъяснения ] требует меньше времени [ нужна ссылка ] . ХИТЫ и TraDIS [ нужны разъяснения ] использовать разрез ДНК [ нужны разъяснения ] различных метод, позволяющий получать продукты ПЦР размеров, что может привести к предпочтительной амплификации более коротких матриц ДНК по сравнению с более длинными матрицами. Tn-seq производит продукт однородного размера, что снижает вероятность систематической ошибки ПЦР. [ 10 ]
Tn-seq можно использовать как для определения приспособленности отдельных генов, так и для картирования взаимодействий генов в микроорганизмах. Существующие методы для этих типов исследований зависят от ранее существовавших геномных микрочипов или массивов с нокаутом генов, тогда как Tn-seq - нет. Использование в Tn-seq массово-параллельного секвенирования делает этот метод легко воспроизводимым, чувствительным и надежным. [ 10 ] [ нужны разъяснения ]
Приложения
[ редактировать ]Tn-seq оказался полезным методом выявления новых функций генов. [ нужны разъяснения ] Высокочувствительная природа Tn-seq [ нужна ссылка ] может быть использован для определения отношений фенотип-генотип, которые могли бы быть сочтены незначительными с помощью менее чувствительных методов. Tn-seq выявил важные гены и пути, которые важны для утилизации холестерина микобактериями туберкулеза . [ 16 ]
Tn-seq использовался для изучения организации генома более высокого порядка с использованием взаимодействий генов. [ нужна ссылка ] Гены функционируют как тесно связанная сеть. [ нужна ссылка ] . Следовательно, чтобы изучить влияние гена на фенотип , необходимо также учитывать взаимодействие генов. [ нужна ссылка ] . Эти генные сети можно изучать путем скрининга на синтетическую летальность и взаимодействие генов, когда двойной мутант демонстрирует неожиданную ценность приспособленности по сравнению с каждым отдельным мутантом. [ нужны разъяснения ] [ нужна ссылка ] . Tn-seq использовался для определения генетических взаимодействий между пятью генами запроса и остальной частью генома Streptococcus pneumoniae, что выявило как усугубляющее, так и облегчающее генетические взаимодействия. [ 4 ] [ нужны разъяснения ] [ 10 ]
Tn-seq, используемый в сочетании с RNA-seq, можно использовать для изучения роли некодирующих участков ДНК. [ 17 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Гавронски Дж.Д., Вонг С.М., Яннукос Г., Уорд Д.В., Акерли Б.Дж.. Отслеживание инсерционных мутантов в библиотеках посредством глубокого секвенирования и полногеномного скрининга генов Haemophilus, необходимых в легких. Proc Natl Acad Sci США. 2009;106:16422–7. дои: 10.1073/pnas.0906627106. Бесплатная статья ЧВК
- ^ Гудман А.Л., МакНалти Н.П., Чжао Ю., Лейп Д., Митра Р.Д., Лозупоне Калифорния и др. Идентификация генетических детерминант, необходимых для установления кишечного симбионта человека в его среде обитания. Микроб-хозяин клетки. 2009;6:279–89. doi: 10.1016/j.chom.2009.08.003.
- ^ Лэнгридж Г.К., Фан М.Д., Тернер Д.Д., Перкинс Т.Т., Партс L, Хаазе Дж. и др. Одновременный анализ каждого гена Salmonella Typhi с использованием миллиона мутантов транспозонов. Геном Рез. 2009;19:2308–16. дои: 10.1101/гр.097097.109.
- ^ Jump up to: а б ван Опийнен Т., Боди К.Л., Камилли А. Tn-seq: высокопроизводительное параллельное секвенирование для исследований приспособленности и генетического взаимодействия микроорганизмов. Нац методы. 2009;6:767–72. дои: 10.1038/nmeth.1377.
- ^ Jump up to: а б с Барквист Л., Бойнетт С.Дж., Кейн А.К. (июль 2013 г.). «Подходы к исследованию бактериальных геномов с помощью секвенирования вставки транспозонов» . Биология РНК . 10 (7): 1161–9. дои : 10.4161/rna.24765 . ПМЦ 3849164 . ПМИД 23635712 .
- ^ Хейс Ф (2003). «Стратегии микробной функциональной геномики и протеомики на основе транспозонов». Ежегодный обзор генетики . 37 (1): 3–29. дои : 10.1146/annurev.genet.37.110801.142807 . ПМИД 14616054 .
- ^ Клекнер Н., Чан Р.К., Тай Б.К., Ботштейн Д. (октябрь 1975 г.). «Мутагенез путем введения элемента лекарственной устойчивости, несущего инвертированное повторение». Журнал молекулярной биологии . 97 (4): 561–75. дои : 10.1016/s0022-2836(75)80059-3 . ПМИД 1102715 .
- ^ Смит В., Чоу К.Н., Лашкари Д., Ботштейн Д., Браун П.О. (декабрь 1996 г.). «Функциональный анализ генов дрожжевой хромосомы V методом генетического следа». Наука . 274 (5295): 2069–74. Бибкод : 1996Sci...274.2069S . дои : 10.1126/science.274.5295.2069 . ПМИД 8953036 .
- ^ Акерли Б.Дж., Рубин Э.Дж., Камилли А., Лампе DJ, Робертсон Х.М., Мекаланос Дж.Дж. (июль 1998 г.). «Систематическая идентификация основных генов с помощью морского мутагенеза in vitro» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 95 (15): 8927–32. Бибкод : 1998PNAS...95.8927A . дои : 10.1073/pnas.95.15.8927 . ПМК 21179 . ПМИД 9671781 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж ван Опийнен Т., Боди К.Л., Камилли А. (октябрь 2009 г.). «Tn-seq: высокопроизводительное параллельное секвенирование для изучения приспособленности и генетического взаимодействия микроорганизмов» . Природные методы . 6 (10): 767–72. дои : 10.1038/nmeth.1377 . ПМЦ 2957483 . ПМИД 19767758 .
- ^ Мазуркевич П., Тан С.М., Бун С., Холден Д.В. (декабрь 2006 г.). «Мутагенез с сигнатурными метками: мутанты со штрих-кодированием для полногеномных экранов» . Обзоры природы Генетика . 7 (12): 929–39. дои : 10.1038/nrg1984 . ПМИД 17139324 . S2CID 27956117 .
- ^ Борк П. (апрель 2000 г.). «Сила и подводные камни анализа последовательностей: барьер в 70%» . Геномные исследования . 10 (4): 398–400. дои : 10.1101/гр.10.4.398 . ПМИД 10779480 .
- ^ Касиф С., Штеффен М. (январь 2010 г.). «Биохимические сети: эволюция аннотации генов» . Химическая биология природы . 6 (1): 4–5. дои : 10.1038/nchembio.288 . ПМЦ 2907659 . ПМИД 20016491 .
- ^ Гудман А.Л., Макналти Н.П., Чжао Ю., Лейп Д., Митра Р.Д., Лозупоне К.А., Найт Р., Гордон Джи (сентябрь 2009 г.). «Определение генетических детерминант, необходимых для установления кишечного симбионта человека в его среде обитания» . Клетка-хозяин и микроб . 6 (3): 279–89. дои : 10.1016/j.chom.2009.08.003 . ПМЦ 2895552 . ПМИД 19748469 .
- ^ Морган Р.Д., Дуинелл Э.А., Бхатия Т.К., Ланг Э.М., Люйтен Ю.А. (август 2009 г.). «Семейство MmeI: ферменты рестрикции-модификации типа II, которые используют одноцепочечную модификацию для защиты хозяина» . Исследования нуклеиновых кислот . 37 (15): 5208–21. дои : 10.1093/нар/gkp534 . ПМК 2731913 . ПМИД 19578066 .
- ^ Гриффин Дж.Э., Гавронски Дж.Д., Деджесус М.А., Йоргер Т.Р., Акерли Б.Дж., Сассетти CM (сентябрь 2011 г.). «Фенотипическое профилирование с высоким разрешением определяет гены, необходимые для роста микобактерий и катаболизма холестерина» . ПЛОС Патогены . 7 (9): e1002251. дои : 10.1371/journal.ppat.1002251 . ПМК 3182942 . ПМИД 21980284 .
- ^ Манн Б., ван Опийнен Т., Ван Дж., Оберт С., Ван Ю.Д., Картер Р., МакГолдрик Дж., Ридаут Г., Камилли А., Туоманен Э.И., Рош Дж.В. (2012). «Контроль вирулентности с помощью малых РНК у Streptococcus pneumoniae» . ПЛОС Патогены . 8 (7): e1002788. дои : 10.1371/journal.ppat.1002788 . ПМК 3395615 . ПМИД 22807675 .