Аналитическое ультрацентрифугирование

Аналитическое ультрацентрифугирование — это аналитический метод, сочетающий ультрацентрифугу с системами оптического мониторинга.

В аналитической ультрацентрифуге (обычно сокращенно AUC) профиль седиментации образца контролируется в реальном времени с помощью оптической системы обнаружения. Образец обнаруживается с помощью оптической чувствительной к показателю преломления системы поглощения ультрафиолетового света и/или интерференции, контролируемой светочувствительной диодной матрицей или пленкой в старых машинах. Таким образом, оператор может наблюдать изменение концентрации образца по отношению к оси профиля вращения во времени в результате приложенного центробежного поля. С помощью современного оборудования эти наблюдения оцифровываются в электронном виде и сохраняются для дальнейшего математического анализа.

Информация, которую можно получить с помощью аналитической ультрацентрифуги, включает общую форму макромолекул , конформационные изменения макромолекул и распределение макромолекул по размерам. С помощью AUC можно получить информацию о количестве и стехиометрии субъединиц нековалентных белки комплексов и константах равновесия макромолекул, таких как , ДНК , наночастицы или другие сборки из разных классов молекул. Простейшим измерением, которое необходимо получить, является коэффициент седиментации , который зависит от размера осаждаемых молекул. Это отношение скорости осаждения частицы к приложенному ускорению, вызывающему осаждение.

В последнее время наблюдается рост использования аналитического ультрацентрифугирования из-за возросшей простоты анализа с помощью современных компьютеров и разработки программного обеспечения, включая пакет программного обеспечения SedFit, поддерживаемый Национальными институтами здравоохранения .

История

Инструментарий

Аналитическая ультрацентрифуга имеет источник света и оптические детекторы. Чтобы свет мог проходить через аналит во время работы ультрацентрифуги, необходимы специализированные ячейки, которые должны соответствовать высоким оптическим стандартам, а также противостоять центробежным силам. Каждая ячейка состоит из корпуса, двух окон из оптически чистого кварцевого стекла и центральной части с одним или двумя секторами и заливочными отверстиями для сектора(ов), закрывающимися в корпусе резьбовой пробкой. Эти ячейки помещаются в полость ротора со сплошным отверстием и воротником внизу для удержания ячейки.

Теория

Виды экспериментов

Применяя специальное оборудование и адаптируя параметры измерения, можно проводить несколько типов экспериментов.Наиболее распространенными экспериментами AUC являются эксперименты по скорости седиментации и седиментационному равновесию.

Скорость седиментации

Эксперименты по скорости седиментации определяют форму и молярную массу аналитов, а также их распределение по размерам. ^[2] Размерное разрешение этого метода масштабируется примерно пропорционально квадрату радиусов частиц, и путем регулировки скорости ротора в эксперименте диапазон размеров от 100 Да можно охватить до 10 ГДа. Эксперименты по скорости седиментации также можно использовать для изучения обратимого химического равновесия между видами макромолекул либо путем мониторинга количества и молярной массы макромолекулярных комплексов, либо путем получения информации о сложном составе с помощью многосигнального анализа, используя различия в спектроскопическом сигнале каждого компонента, либо путем следуя зависимости скорости седиментации макромолекулярной системы от состава, как описано в теории Гилберта-Дженкинса .

Целью эксперимента является мониторинг поведения седиментации при фиксированной угловой скорости.

Седиментационное равновесие

Эксперименты по седиментационному равновесию сообщают о молярной массе аналитов и их константах химического равновесия . ^[3] Скорость ротора регулируется таким образом, чтобы формировался устойчивый профиль концентрации c(r) образца в ячейке, в котором седиментация и диффузия компенсируют друг друга.

Центрифугирование в градиенте плотности

Оценка данных

См. также

Ссылки

^ «Техническое руководство к ультрацентрифуге Spinco, модель E» . Цифровые коллекции Института истории науки . Проверено 18 декабря 2018 г.
^ Перес-Рамирес, Б. и Стекерт, Дж. Дж. (2005). Терапевтические белки: методы и протоколы. К.М. Смейлс и Д.К. Джеймс, ред. Том 308: 301–318. Humana Press Inc, Тотова, Нью-Джерси.
^ Гирландо, Р. (2011). «Анализ макромолекулярных взаимодействий методом седиментационного равновесия» . Современное аналитическое ультрацентрифугирование: методы . 58 (1): 145–156. дои : 10.1016/j.ymeth.2010.12.005 . ПМК 3090454 . ПМИД 21167941 .

Внешние ссылки

Дальнейшее чтение

Лебовиц Дж., Льюис М.С., Шук П. (январь 2005 г.). «Современное аналитическое ультрацентрифугирование в науке о белках: обзор учебного пособия» . Белковая наука . 102 (9): 2067–2069. дои : 10.1110/ps.0207702 . ПМЦ 2373601 . ПМИД 12192063 .
Бальбо А., Минор К.Х., Великовский К.А., Мариуцца Р.А., Петерсон С.Б., Шук П. (январь 2005 г.). «Изучение мультибелковых комплексов методом мультисигнального скоростного аналитического ультрацентрифугирования» . ПНАС . 102 (1): 81–86. Бибкод : 2005PNAS..102...81B . дои : 10.1073/pnas.0408399102 . ПМК 538923 . ПМИД 15613487 .
Коул Дж., Хансен Дж. (декабрь 1999 г.). «Аналитическое ультрацентрифугирование как современный инструмент биомолекулярных исследований» . Джей Биомол Тех . 10 (4): 163–76. ПМК 2291609 . ПМИД 19499023 .

[1] «Техническое руководство к ультрацентрифуге Spinco, модель E» . Цифровые коллекции Института истории науки . Проверено 18 декабря 2018 г.

[2] Перес-Рамирес, Б. и Стекерт, Дж. Дж. (2005). Терапевтические белки: методы и протоколы. К.М. Смейлс и Д.К. Джеймс, ред. Том 308: 301–318. Humana Press Inc, Тотова, Нью-Джерси.

[3] Гирландо, Р. (2011). «Анализ макромолекулярных взаимодействий методом седиментационного равновесия» . Современное аналитическое ультрацентрифугирование: методы . 58 (1): 145–156. дои : 10.1016/j.ymeth.2010.12.005 . ПМК 3090454 . ПМИД 21167941 .

[1]

[2]

[3]