Фотоиндуцированная сшивка немодифицированных белков

Фотоиндуцированное сшивание немодифицированных белков (PICUP) представляет собой метод сшивания белков путем облучения фотокатализатора видимым светом в присутствии акцептора электронов и интересующего белка. ^{[ 1 ]} Облучение приводит к образованию высокореактивного белкового радикала, который образует ковалентную связь между боковыми цепями аминокислот связываемых белков. Методы сшивания, разработанные до PICUP, включая использование физических, окислительных и химических сшивающих агентов, часто требуют больше времени и приводят к образованию белковых побочных продуктов. ^{[ 2 ]} Кроме того, выход сшитого белка очень низок из-за многофункциональности сшивающих реагентов.

Этот процесс был изобретен (US6613582B1) в 1999 году с целью использования методов перекрестного связывания белков для анализа взаимодействий между полипептидами, а также структурных различий, которые белки претерпевают на каталитическом пути . Технологии 20-го века были недостаточными для того, чтобы их можно было применять для сшивания быстрых и временных изменений этих белков с высоким выходом. PICUP позволил обеспечить быстрое (<1 секунды) и высокое производство ковалентно связанных белков в непосредственной близости друг от друга. ^{[ 2 ]}

История

Фэнси и Кодадек

Изобретение PICUP Фэнси и Кодадеком в 1999 году стало первым случаем, когда сшивку белков можно было выполнить за такой короткий период времени (1 секунду) и без изменения структуры рассматриваемых белков. ^{[ 2 ]} Кроме того, PICUP можно было проводить при физиологическом pH 7,4, что открыло двери для дальнейшего применения сшивки белков, например, для изучения биохимических механизмов участия белков в организме человека. Кроме того, облучение видимым светом в PICUP полезно, поскольку многие биомолекулы, которые участвуют в анализируемых метаболических путях, не поглощают свет с длинами волн ниже диапазона УФ-излучения , что позволяет образовывать поперечные связи без денатурации. ^{[ 2 ]}

Битан, Ломакин и Теплов

В 2001 году Галь Битан, Алексей Ломакин и Дэвид Б. Теплоу применили PICUP для изучения олигомеризации амилоидного β-белка (Aβ) , которая наблюдается при болезни Альцгеймера. ^{[ 3 ]} PICUP позволил идентифицировать и количественно оценить олигомеры Aβ, которые являются метастабильными из-за их способности быстро сшиваться. ^{[ 3 ]} При сочетании PICUP с электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) количественно определяли распределение олигомеров в быстром равновесии. ^{[ 3 ]} Это приложение позволило изучить амилоидогенные белки, связанные с нейродегенеративными заболеваниями, и открыло двери для возможных будущих терапевтических механизмов. В настоящее время предполагается, что нейродегенеративные заболевания являются результатом воздействия нейротоксичных белков, поэтому возможность изучения распределения их олигомеров эффективна для понимания того, как и при каких условиях образуются эти олигомеры.

Механизм

Механизм PICUP требует наличия комплекса трис(бипиридил)Ru(II) , акцептора электронов, персульфата аммония (APS) и реакционноспособных боковых цепей аминокислот. ^{[ 2 ]} Гексагидрат трис(2,2'-бипиридил)дихлоррутения(II), комплекс трис(бипиридил)Ru(II), первоначально содержит Ru ²⁺. ^{[ 4 ]} При облучении видимым светом и в присутствии персульфата аммония (АПС) Ru ²⁺ переходит в возбужденное состояние и окисляется до Ru ³⁺. ^{[ 4 ]} Ру ³⁺ теперь является чрезвычайно реактивным окислителем, который хочет принять только один электрон вместо стандартных двух. ^{[ 4 ]} Реакция может протекать и в отсутствие акцептора электронов, но она будет иметь гораздо меньшую эффективность, образуя побочные продукты в результате реакции возбужденного Ru(Bpy) ₃ с кислородом. ^{[ 5 ]} Как эффективный одноэлектронный окислитель, Ru ³⁺ заберет один электрон от аминокислот соседних белков, чаще всего триптофана и тирозина . ^{[ 4 ]} Это приводит к образованию радикала , который очень нестабильен в боковых цепях аминокислот, который в результате реакций достигает более стабильного состояния.

Неспаренный одиночный электрон боковой цепи реагирует с другой боковой цепью аминокислоты полипептида, находящегося поблизости, в результате чего образуется димер с ковалентной связью. ^{[ 4 ]} С возрождением Ру ²⁺ когда Ру ³⁺ забирает электрон у аминокислот, обеспечивает непрерывное образование радикалов с Ru ³⁺ окисляется АПС. ^{[ 2 ]}

В пробирке для ПЦР, в которой протекает реакция, многочисленные нестабильные белковые радикалы вступают в контакт друг с другом посредством простой диффузии и реагируют как внутри-, так и межмолекулярно, достигая более стабильного состояния. Мономерные белковые радикалы способны достигать более низкого энергетического состояния за счет образования ковалентной связи с образованием димера и высвобождения атома водорода. ^{[ 4 ]} ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ: на изображении ошибочно показано высвобождение протона, и его не следует использовать в такой форме (см. также ссылку 4). С создателем связались. Этот вновь образованный димер также способен реагировать со многими другими мономерами или димерами по тому же механизму, создавая большее количество сшитых олигомеров. ^{[ 4 ]} Это позволяет обеспечить присутствие в смеси различных олигомеров.

Метод

В каждом эксперименте важно определить относительную концентрацию рассматриваемого белка, персульфата аммония и гексагидрата трис(2,2'-бипиридил)дихлоррутения(II), которые будут использоваться в эксперименте по сшиванию белка. Предыдущие эксперименты показали, что для амилоидного β-белка (Aβ), пептида, предположительно вызывающего токсичность при болезни Альцгеймера , соотношение белок: Ru(Bpy) ₃ : APS составляет 1:2:40. ^{[ 3 ]} Соотношение Ru(Bpy) ₃ и APS предлагается сохранять на этом уровне, но соответствующая концентрация данного белка может варьироваться. Для многих белков, для которых PICUP еще не использовался, найти подходящие концентрации можно методом проб и ошибок. Как правило, концентрации белка должны находиться в диапазоне от 10 до 50 мкМ, растворенного в соответствующем буфере, скорее всего, фосфате натрия, при тестировании в условиях физиологического pH. Однако некоторые исследования чистого белка показывают, что соотношение белка и Ru(Bpy) ₃ также следует поддерживать на уровне 1:2. ^{[ 4 ]} Этот уровень возникает из-за того, что меньшее количество Ru(Bpy) ₃ может привести к тому, что в образце белка окажется больше фактического количества олигомеров более высокого порядка, а большее количество Ru(Bpy) ₃ может привести к искусственному перекрестному скрещиванию. -связывание побочных продуктов.

Общий метод PICUP следующий:

Соответствующее количество белка вносят пипеткой в пробирку для полимеразной цепной реакции (ПЦР). ^{[ 6 ]}
К образцу добавляют персульфат аммония (APS) и гексагидрат трис(2,2'-бипиридил)дихлоррутения(II) и кратковременно перемешивают. ^{[ 6 ]}
Пробирку для ПЦР помещают в стеклянный флакон, чтобы она оставалась внутри сильфона камеры, которая может облучать смесь. После закрытия крышки, закрывающей камеру, нажатие затвора камеры освещает трубку в течение того времени, на которое вы запрограммировали камеру для облучения. Использование одной и той же камеры для каждого повтора эксперимента гарантирует, что время облучения и расстояние от источника света контролируются для каждого эксперимента PICUP. ^{[ 6 ]}
После облучения образца в пробирке для ПЦР к смеси немедленно добавляют расчетное количество 1М дитиотреитола (ДТТ) для гашения реакции. Если реакцию не погасить, олигомеры будут постоянно агрегировать, и олигомеры более низкого порядка не будут присутствовать в смеси. Кроме того, если SDS-PAGE будет использоваться для анализа распределения олигомеров белков после PICUP, DTT также будет действовать как денатурирующий агент для белков перед гель-электрофорезом. ^{[ 6 ]}

Приложения

Использование PICUP на белковых комплексах полезно для получения каталитической и кинетической информации об этих белках, поскольку каталитические механизмы являются быстрыми, а PICUP позволяет быстро и высокоэффективно сшивать белки. ^{[ 5 ]} Было показано, что на некоторые эпитопные и аффинные метки не влияет реакция PICUP, что позволяет визуализировать сшитые белки. ^{[ 5 ]}

Кроме того, PICUP позволяет визуализировать количественные полосы распределения белковых олигомеров в сочетании с методами фракционирования белков. Эта комбинация особенно полезна при исследовании олигомеров нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера , болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона , которые возникают в результате агрегации белков. ^{[ 1 ]} PICUP чрезвычайно важен при изучении возможных процедур профилактики и лечения этих заболеваний, поскольку необходимо исследовать склонность к агрегации соответствующих амилоидогенных белков .

См. также

перекрестная ссылка

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б Рахими, Фарид; Маити, Панчанан; Битан, Гал (12 января 2009 г.). «Фотоиндуцированное сшивание немодифицированных белков (PICUP) применительно к амилоидогенным пептидам» . Журнал визуализированных экспериментов (23). дои : 10.3791/1071 . ISSN 1940-087X . ПМЦ 2763294 . ПМИД 19229175 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Фэнси, Дэвид А.; Кодадек, Томас (25 мая 1999 г.). «Химия для анализа белок-белковых взаимодействий: быстрое и эффективное сшивание, вызываемое длинноволновым светом» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 96 (11): 6020–6024. Бибкод : 1999PNAS...96.6020F . дои : 10.1073/pnas.96.11.6020 . ISSN 0027-8424 . ПМК 26828 . ПМИД 10339534 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Битан, Гал; Ломакин, Алексей; Теплоу, Дэвид Б. (14 сентября 2001 г.). «Олигомеризация β-амилоидного белка. ПРЕНУКЛЕАЦИОННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ, ВЫЯВЛЯЕМЫЕ ПОСРЕДСТВОМ ФОТОИНДУЦИРОВАННОЙ ПОКРЕСТНОЙ СШИВКИ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ БЕЛКОВ» . Журнал биологической химии . 276 (37): 35176–35184. дои : 10.1074/jbc.M102223200 . ISSN 0021-9258 . ПМИД 11441003 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час Битан, Гал (2006). Структурное исследование метастабильных амилоидогенных белковых олигомеров путем фотоиндуцированного сшивания немодифицированных белков . Методы энзимологии. Том. 413. стр. 217–236. дои : 10.1016/S0076-6879(06)13012-8 . ISBN 9780121828189 . ISSN 0076-6879 . ПМЦ 2782599 . ПМИД 17046399 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Фэнси, окружной прокурор; Денисон, К.; Ким, К.; Се, Ю.; Холдеман, Т.; Амини, Ф.; Кодадек, Т. (сентябрь 2000 г.). «Объем, ограничения и механистические аспекты фотоиндуцированной сшивки белков водорастворимыми металлокомплексами» . Химия и биология . 7 (9): 697–708. дои : 10.1016/s1074-5521(00)00020-x . ISSN 1074-5521 . ПМИД 10980450 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Воллерс, Сабрина С.; Теплоу, Дэвид Б.; Битан, Гал (2004). «Определение состояния олигомеризации пептидов с использованием быстрой фотохимической сшивки». Амилоидные белки . Методы молекулярной биологии. Том. 299. С. 011–018. дои : 10.1385/1-59259-874-9:011 . ISBN 978-1-59259-874-8 . ПМИД 15980592 . S2CID 34037607 .

[:5-1] Jump up to: ^а ^б Рахими, Фарид; Маити, Панчанан; Битан, Гал (12 января 2009 г.). «Фотоиндуцированное сшивание немодифицированных белков (PICUP) применительно к амилоидогенным пептидам» . Журнал визуализированных экспериментов (23). дои : 10.3791/1071 . ISSN 1940-087X . ПМЦ 2763294 . ПМИД 19229175 .

[:0-2] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж Фэнси, Дэвид А.; Кодадек, Томас (25 мая 1999 г.). «Химия для анализа белок-белковых взаимодействий: быстрое и эффективное сшивание, вызываемое длинноволновым светом» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 96 (11): 6020–6024. Бибкод : 1999PNAS...96.6020F . дои : 10.1073/pnas.96.11.6020 . ISSN 0027-8424 . ПМК 26828 . ПМИД 10339534 .

[:1-3] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Битан, Гал; Ломакин, Алексей; Теплоу, Дэвид Б. (14 сентября 2001 г.). «Олигомеризация β-амилоидного белка. ПРЕНУКЛЕАЦИОННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ, ВЫЯВЛЯЕМЫЕ ПОСРЕДСТВОМ ФОТОИНДУЦИРОВАННОЙ ПОКРЕСТНОЙ СШИВКИ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ БЕЛКОВ» . Журнал биологической химии . 276 (37): 35176–35184. дои : 10.1074/jbc.M102223200 . ISSN 0021-9258 . ПМИД 11441003 .

[:2-4] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и ^ж ^г ^час Битан, Гал (2006). Структурное исследование метастабильных амилоидогенных белковых олигомеров путем фотоиндуцированного сшивания немодифицированных белков . Методы энзимологии. Том. 413. стр. 217–236. дои : 10.1016/S0076-6879(06)13012-8 . ISBN 9780121828189 . ISSN 0076-6879 . ПМЦ 2782599 . ПМИД 17046399 .

[:4-5] Jump up to: ^а ^б ^с Фэнси, окружной прокурор; Денисон, К.; Ким, К.; Се, Ю.; Холдеман, Т.; Амини, Ф.; Кодадек, Т. (сентябрь 2000 г.). «Объем, ограничения и механистические аспекты фотоиндуцированной сшивки белков водорастворимыми металлокомплексами» . Химия и биология . 7 (9): 697–708. дои : 10.1016/s1074-5521(00)00020-x . ISSN 1074-5521 . ПМИД 10980450 .

[:3-6] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Воллерс, Сабрина С.; Теплоу, Дэвид Б.; Битан, Гал (2004). «Определение состояния олигомеризации пептидов с использованием быстрой фотохимической сшивки». Амилоидные белки . Методы молекулярной биологии. Том. 299. С. 011–018. дои : 10.1385/1-59259-874-9:011 . ISBN 978-1-59259-874-8 . ПМИД 15980592 . S2CID 34037607 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]