CITE-Seq
CITE-Seq ( клеточное а индексирование транскриптомов , и E- питопов путем секвенирования ) — это метод секвенирования РНК также получения количественной и качественной информации о поверхностных белках с доступными антителами на уровне одной клетки. [ 1 ] На данный момент было продемонстрировано, что этот метод работает лишь с несколькими белками на клетку. Таким образом, он обеспечивает дополнительный уровень информации для одной и той же клетки путем объединения данных как протеомики , так и транскриптомики. показали, что для фенотипирования этот метод так же точен, как и проточная цитометрия (золотой стандарт). Группы, которые его разработали, [ 2 ] В настоящее время это один из основных методов, наряду с REAP-Seq, для одновременной оценки экспрессии генов и уровня белка у разных видов.
Метод был разработан Нью-Йоркским центром генома в сотрудничестве с лабораторией Сатиджи . [ 2 ] в то время как аналогичный подход ранее был продемонстрирован компанией AbVitro Inc.
Приложения
[ редактировать ]Одновременное измерение уровней белка и транскриптов открывает возможности использования CITE-Seq в различных биологических областях, некоторые из которых были затронуты разработчиками. Например, его можно использовать для характеристики гетерогенности опухолей при различных видах рака, что является основной областью исследований. [ 3 ] Это также позволяет идентифицировать редкие субпопуляции клеток с помощью высокопроизводительного одноклеточного метода и, таким образом, обнаруживать информацию, которая в противном случае была бы потеряна при использовании массовых методов. [ 3 ] Это также может помочь в классификации опухолей, например, в идентификации новых подтипов. [ 3 ] Все вышеперечисленное возможно благодаря одновременному выводу в одной клетке данных как белка, так и транскриптов, что также приводит к получению новой информации о корреляции белок-РНК.
Он также имеет потенциал в иммунологии. Например, его можно использовать для характеристики иммунных клеток — недавние исследования Т-клеток выявили способность Т-клеток поддерживать эффекторное состояние. [ 4 ] Другое исследование, проведенное одним из соавторов CITE-Seq, предложило CITE-Seq как метод изучения механизмов взаимодействия хозяина и патогена. [ 5 ]
Рабочий процесс
[ редактировать ]CITE-seq, как и любой другой метод секвенирования, имеет влажную лабораторную часть, где готовятся настоящие антитела, окрашиваются клетки, синтезируются кДНК и подготавливаются библиотеки РНК для дальнейшего секвенирования, а также сухая лабораторная часть для анализа полученных данных секвенирования. . Наиболее важной частью влажных лабораторных экспериментов является разработка конъюгатов антитело-олигонуклеотид и титрование количества каждого конъюгата, которое должно присутствовать в пуле для достижения желаемых результатов и количественного определения.
Рабочий процесс в «мокрой лаборатории»
[ редактировать ]Первый этап включает приготовление конъюгатов антитело-олиго, также известных как ( антител -теги , полученные из Т ADT). Подготовка ADT включает мечение антитела, направленного против интересующего белка клеточной поверхности, олигонуклеотидами для штрих-кодирования антитела.
Когда у вас есть ADT, следующим шагом будет привязка ячеек к желаемому пулу ADT. Библиотеки scRNA-seq можно получить с использованием методов Drop-seq , 10X Genomics или ddSeq. Короче говоря, клетки, меченные ADT, инкапсулированы внутри капли в виде отдельных клеток с микрошариками со штрих-кодом ДНК. [ 6 ]
Внутри капли клетки затем лизируются для высвобождения как связанных ADT, так и мРНК. Затем они преобразуются в кДНК. Каждая последовательность ДНК на микрогранулах имеет уникальный штрих-код, что позволяет индексировать кДНК со штрих-кодами клеток. кДНК получают как из ADT, так и из клеточных мРНК.
На следующем этапе, в соответствии с рекомендациями разработчика, кДНК амплифицируется с помощью ПЦР, а кДНК ADT и кДНК мРНК разделяются по размеру (обычно кДНК, полученные из ADT, имеют размер <180 п.н., а кДНК, полученные из мРНК, имеют размер > 300 п.н.). [ 7 ] Каждую из разделенных молекул кДНК независимо амплифицируют и очищают для получения библиотек секвенирования. Наконец, независимые библиотеки объединяются и секвенируются. Таким образом, данные протеомики и транскриптомики могут быть получены за один цикл секвенирования.
Рабочий процесс сухой лаборатории
[ редактировать ]Анализ секвенирования отдельных клеток представляет множество проблем, таких как определение наилучшего способа нормализации данных. [ 8 ] Из-за нового уровня сложностей, возникающих при секвенировании белков и транскриптов на уровне отдельных клеток, разработчики CITE-Seq и их коллеги поддерживают несколько инструментов, помогающих в анализе данных.
Анализ данных scRNA-Seq на основе рекомендаций разработчика : [ 2 ] [ 9 ] Начальные этапы анализа такие же, как и в стандартном эксперименте scRNA-Seq . Во-первых, чтения должны быть сопоставлены с эталонным геномом интересующего вида, а клетки с очень небольшим количеством транскриптов, сопоставленных с эталонным, удаляются. Наконец, получается нормализованная матрица подсчета со значениями экспрессии генов.
Анализ данных ADT [ 2 ] [ 7 ] [ 10 ] [ 11 ] (на основе рекомендаций разработчика) : CITE-seq-Count — это пакет Python от разработчиков CITE-Seq, который можно использовать для получения необработанных данных. Пакет Seurat из лаборатории Satija также позволяет объединять подсчеты белков и РНК и выполнять кластеризацию по обоим измерениям, а также проводить дифференциальный анализ экспрессии между интересующими кластерами клеток. Количественная оценка ADT должна учитывать различия между антителами. Кроме того, для уменьшения шума может потребоваться фильтрация, аналогично анализу scRNA-Seq . Но в отличие от данных РНК, из-за большего количества белка в клетке выпадение меньше.
Анализы могут привести к идентификации новых кластеров клеток с помощью таких методов, как PCA или tSNE, важнейших генов, ответственных за определенную функцию клетки, и других новых знаний, специфичных для интересующего вопроса. В целом результаты, полученные с помощью подсчета ADT, существенно увеличивают объем информации, получаемой с помощью транскриптомики отдельных клеток.
Адаптации техники
[ редактировать ]
Применение конъюгатов антитело-олигонуклеотиды вышло за рамки CITE-seq и может быть адаптировано для мультиплексирования образцов, а также для скрининга CRISPR .
Хеширование клеток: Нью-Йоркский центр генома дополнительно адаптировал использование своих конъюгатов антитело-олигонуклеотид, чтобы обеспечить мультиплексирование образцов для scRNA-seq . Эта техника называется «Хеширование ячеек». [ 12 ] использует меченные олигонуклеотидами антитела против повсеместно экспрессируемых белков клеточной поверхности из конкретного образца ткани. В этом случае олигонуклеотидная последовательность содержит уникальный штрих-код, специфичный для клеток из разных образцов. Эта маркировка клеток для конкретных образцов позволяет объединять библиотеки секвенирования, подготовленные из разных образцов, на платформе секвенирования. Секвенирование меток антител вместе с клеточным транскриптомом помогает идентифицировать образец происхождения каждой анализируемой клетки. Уникальная последовательность штрих-кода, используемая в антителе для хеширования клеток, может быть спроектирована так, чтобы она отличалась от штрих-кода антитела, присутствующего на ADT, используемых в CITE-seq. Это позволяет объединить хеширование клеток с CITE-seq в одном цикле секвенирования. [ 12 ] Хеширование клеток обеспечивает сверхзагрузку платформы scRNA-seq, что приводит к снижению стоимости секвенирования. Это также позволяет обнаруживать артефактные сигналы от мультиплетов, что является основной проблемой scRNA-seq . Метод хеширования клеток далее использовался Gaublomme et al. мультиплексировать секвенирование одноядерной РНК ( snRNA-seq ) путем выполнения хеширования ядра. [ 13 ]
ECCITE-seq: индексирование и транскриптомов E - расширенное C RISPR-совместимое клеточное питопов путем . секвенирования или ECCITE-seq был разработан для применения использования CITE-seq для характеристики нескольких модальностей из одной клетки Модифицировав базовый протокол CITE-seq на анализ scRNA-seq на основе 5'-меток, он может обнаруживать транскриптом, клонотипы иммунных рецепторов, поверхностные маркеры, идентичность образцов и отдельные направляющие РНК (sgRNA) из каждой отдельной клетки. [ 14 ] Способность ECCITE-seq обнаруживать молекулы sgRNA и измерять их влияние на уровень экспрессии генов открывает перспективу применения этого метода в скрининге CRISPR.
Преимущества и ограничения CITE-seq
[ редактировать ]Преимущества: CITE-seq позволяет одновременно анализировать транскриптом и протеом отдельных клеток. Предыдущие попытки объединить измерения индексной сортировки отдельных клеточных сортов с scRNA-seq были ограничены использованием небольшого размера выборки и не были совместимы с мультиплексированием и массовым параллельным секвенированием с высокой пропускной способностью. Было показано, что CITE-seq совместим с высокопроизводительными микрофлюидными платформами, такими как 10X Genomics и Drop-seq . Он также адаптируется к платформам микро/наноскважин. Сочетание этого с хешированием ячеек позволяет применять CITE-seq к объемным образцам и мультиплексированию образцов. Эти методы позволяют снизить общую стоимость высокопроизводительного секвенирования нескольких образцов. Наконец, CITE-seq можно адаптировать для обнаружения малых молекул, РНК-интерференции, CRISPR и других методов редактирования генов.
Ограничения: Одним из ограничений CITE-Seq является потеря информации о местоположении. Из-за способа обработки клеток пространственное распределение клеток внутри образца, а также белков внутри клетки неизвестно. [ 15 ] [ 9 ] Кроме того, этот метод разделяет проблемы scRNA-Seq, такие как большое количество шума и возможные проблемы с обнаружением слабо экспрессируемых генов. [ 9 ] С точки зрения фенотипирования оптимизация анализа и антител также представляет собой потенциальную проблему, если интересующие белки не включены в доступные в настоящее время панели. [ 16 ] Более того, сейчас CITE-Seq не способен обнаруживать внутриклеточные белки. [ 16 ] В соответствии с текущим протоколом существует множество проблем, которые могут возникнуть на этапе пермеабилизации, что ограничивает метод поверхностными маркерами.
Альтернативные методы
[ редактировать ]- REAP-seq: Peterson et al. Компания Merck разработала метод, аналогичный CITE-seq, под названием анализ экспрессии РНК и секвенирования белков (REAP-seq). Хотя REAP-seq, как и CITE-seq, измеряет уровни как транскриптов, так и белков в одной клетке, разница между этими двумя методами заключается в том, как антитело конъюгируется с олигонуклеотидами. CITE-seq обычно связывает олигонуклеотид с антителом нековалентно, посредством конъюгации стрептавидина с антителом и конъюгации биотина с олигонуклеотидом. REAP-seq ковалентно связывает антитело и аминированный штрих-код ДНК. [ 17 ]
- PLAYR: PLAYR или анализ проксимального лигирования РНК использует масс-спектрометрию для одновременного анализа уровней транскриптома и белка в отдельных клетках. В этом методе как белки, так и транскрипты РНК метятся изотопно-конъюгированными антителами и изотопно-меченными зондами соответственно, что позволяет их обнаруживать на масс-спектрометре. [ 18 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Меркателли, Даниэле; Бальбони, Никола; Де Джорджио, Франческа; Алео, Эмануэла; Гароне, Катерина; Джорджи, Федрико М. (06 мая 2021 г.). «Транскриптом SH-SY5Y с разрешением одной клетки: рабочий процесс анализа данных CITE-Seq» . Методы и протоколы . 4 (2): 28. дои : 10.3390/mps4020028 . ISSN 2409-9279 . ПМК 8163004 . ПМИД 34066513 .
- ^ Jump up to: а б с д Стоецкиус, Марлон; Хафемейстер, Кристоф; Стивенсон, Уильям; Хоук-Лумис, Брайан; Чаттопадхьяй, Пратип К; Свердлов, Гарольд; Сатиджа, Рахул; Смайберт, Питер (31 июля 2017 г.). «Одновременное измерение эпитопа и транскриптома в отдельных клетках» . Природные методы . 14 (9): 865–868. дои : 10.1038/nmeth.4380 . ISSN 1548-7091 . ПМК 5669064 . ПМИД 28759029 .
- ^ Jump up to: а б с Тирош, Итай; Сува, Марио Л. (16 ноября 2018 г.). «Расшифровка биологии опухолей человека с помощью анализа экспрессии отдельных клеток» . Ежегодный обзор биологии рака . 3 (1): 151–166. doi : 10.1146/annurev-cancerbio-030518-055609 . ISSN 2472-3428 . S2CID 53969464 .
- ^ Гутьеррес-Арселус, Мария; Теслович, Никола; Мола, Алекс Р.; Полидоро, Рафаэль Б.; Натан, Апарна; Ким, Хён; Ханнес, Сьюзен; Словиковский, Камил; Уоттс, Джеральд FM (08 февраля 2019 г.). «Врожденная природа лимфоцитов, определяемая состояниями транскрипции, отражает баланс между пролиферацией и эффекторными функциями» . Природные коммуникации . 10 (1): 687. Бибкод : 2019NatCo..10..687G . дои : 10.1038/s41467-019-08604-4 . ISSN 2041-1723 . ПМК 6368609 . ПМИД 30737409 .
- ^ Чаттопадхьяй, Пратип К.; Редерер, Марио; Болтон, Дайан Л. (06 ноября 2018 г.). «Смертельный танец: хореография взаимодействия хозяина и патогена, выявленная с помощью одноклеточных технологий» . Природные коммуникации . 9 (1): 4638. Бибкод : 2018NatCo...9.4638C . дои : 10.1038/s41467-018-06214-0 . ISSN 2041-1723 . ПМК 6219517 . ПМИД 30401874 .
- ^ Макоско, Эван З.; Басу, Аниндита; Сатиджа, Рахул; Немеш, Джеймс; Шекхар, Картик; Гольдман, Мелисса; Тирош, Итай; Биалас, Эллисон Р.; Камитаки, Нолан (май 2015 г.). «Высокопараллельное полногеномное профилирование экспрессии отдельных клеток с использованием нанолитровых капель» . Клетка . 161 (5): 1202–1214. дои : 10.1016/j.cell.2015.05.002 . ISSN 0092-8674 . ПМЦ 4481139 . ПМИД 26000488 .
- ^ Jump up to: а б «СИТЕ-сек» . СИТЕ-сек . Проверено 27 февраля 2019 г.
- ^ Гао, Шан (2018), «Анализ данных при секвенировании одноклеточного транскриптома», Вычислительная системная биология , Методы молекулярной биологии, том. 1754, Springer New York, стр. 311–326, doi : 10.1007/978-1-4939-7717-8_18 , ISBN. 9781493977161 , PMID 29536451
- ^ Jump up to: а б с Лю, Серена; Трапнелл, Коул (17 февраля 2016 г.). «Секвенирование одноклеточного транскриптома: последние достижения и оставшиеся проблемы» . F1000Исследования . 5 : 182. doi : 10.12688/f1000research.7223.1 . ISSN 2046-1402 . ПМЦ 4758375 . ПМИД 26949524 .
- ^ Ролли, Патрик (23 февраля 2019 г.), Небольшой скрипт, позволяющий подсчитывать ТЕГИ из эксперимента CITE-seq: Hoohm/CITE-seq-Count , получено 27 февраля 2019 г.
- ^ «Сёра» . satijalab.org . Проверено 27 февраля 2019 г.
- ^ Jump up to: а б Стоецкиус, Марлон; Чжэн, Шивэй; Хоук-Лумис, Брайан; Хао, Стефани; Юнг, Бертран; Смайберт, Питер; Сатиджа, Рахул (21 декабря 2017 г.). «Хеширование клеток» с помощью антител со штрих-кодом обеспечивает мультиплексирование и обнаружение дублетов для геномики одиночных клеток» . Геномная биология . 19 (1): 224. bioRxiv 10.1101/237693 . дои : 10.1186/s13059-018-1603-1 . ПМК 6300015 . ПМИД 30567574 .
- ^ Гаубломм, Джеллерт Т.; Ли, Бо; Маккейб, Кристин; Кнехт, Эбигейл; Дрохлянский, Евгений; Ван Виттенберге, Николас; Уолдман, Джулия; Дионн, Даниэль; Нгуен, Лан (23 ноября 2018 г.). «Мультиплексирование ядер с антителами со штрих-кодом для одноядерной геномики» . биоRxiv . дои : 10.1101/476036 . hdl : 1721.1/125028 .
- ^ Мимиту, Элени; Ченг, Энтони; Монтальбано, Антонино; Хао, Стефани; Стоецкиус, Марлон; Легут, Матеуш; Руш, Тимоти; Эррера, Альберто; Папалекси, Эфтимия (08.11.2018). «Расширение набора инструментов CITE-seq: обнаружение белков, транскриптомов, клонотипов и изменений CRISPR с помощью мультиплексирования в одном анализе» . биоRxiv . дои : 10.1101/466466 .
- ^ Ань, Синъюэ; Варадараджан, Навин (март 2018 г.). «Одноклеточные технологии для профилирования Т-клеток для мониторинга иммунотерапии» . Текущее мнение в области химической инженерии . 19 : 142–152. дои : 10.1016/j.coche.2018.01.003 . ISSN 2211-3398 . ПМК 6530921 . ПМИД 31131208 .
- ^ Jump up to: а б барон, Мааян; Янаи, Итай (24 августа 2017 г.). «Новый скин для старой церемонии RNA-Seq: эпоха одноклеточных мультиомиков» . Геномная биология . 18 (1): 159. дои : 10.1186/s13059-017-1300-5 . ISSN 1474-760X . ПМЦ 5571565 . ПМИД 28837001 .
- ^ Петерсон, Ванесса М; Чжан, Кельвин Си; Кумар, Намит; Вонг, Джерелин; Ли, Ликсия; Уилсон, Дуглас С; Мур, Рене; МакКланахан, Террилл К.; Садекова, Светлана (30 августа 2017 г.). «Мультиплексная количественная оценка белков и транскриптов в отдельных клетках». Природная биотехнология . 35 (10): 936–939. дои : 10.1038/nbt.3973 . ISSN 1087-0156 . ПМИД 28854175 . S2CID 205285357 .
- ^ Фрай, Андреас П; Бава, Феличе-Алессио; Зундер, Эли Р.; Се, Елена Вайоминг; Чен, Ши-Ю; Нолан, Гарри П; Герардини, Пьер Федерико (25 января 2016 г.). «Высокомультиплексное одновременное обнаружение РНК и белков в отдельных клетках» . Природные методы . 13 (3): 269–275. дои : 10.1038/nmeth.3742 . ISSN 1548-7091 . ПМЦ 4767631 . ПМИД 26808670 .