Технология подвесных массивов
Технология суспензионных матриц (или SAT ) — это высокопроизводительная, крупномасштабная и мультиплексированная платформа скрининга, используемая в молекулярной биологии . SAT широко применяется в геномных и протеомных исследованиях, таких как генотипирование однонуклеотидного полиморфизма (SNP), генетических заболеваний скрининг , профилирование экспрессии генов , скрининг открытия лекарств и клиническая диагностика. [1] [2] [3] SAT использует микросферические шарики (диаметром 5,6 мкм) для приготовления массивов. SAT позволяет одновременно тестировать несколько вариантов генов с помощью этих микросферических шариков, поскольку каждый тип микросферических шариков имеет уникальную идентификацию, основанную на различиях в оптических свойствах, наиболее распространенным из которых является флуоресцентный цвет. Поскольку каждый цвет и интенсивность цвета имеют уникальную длину волны, бусины можно легко отличить по интенсивности их длины волны. Микросферы легко суспендировать в растворе и демонстрируют благоприятную кинетику во время анализа. Подобно плоским микрочипам (например, ДНК-микрочипам ), соответствующая молекула рецептора, такая как ДНК- олигонуклеотидные зонды, антитела или другие белки , прикрепляется к по-разному меченным микросферам. Таким образом производятся тысячи элементов массива микросфер. Гибридизация зонда-мишени обычно обнаруживается по оптически меченным мишеням, что определяет относительное содержание каждой мишени в образце. [4]
Обзор SAT с использованием гибридизации ДНК
[ редактировать ]
ДНК извлекается из клеток, используемых для создания тестовых фрагментов. Эти тестовые фрагменты добавляют к раствору, содержащему различные микросферические шарики. Каждый тип микросфер содержит известный ДНК-зонд с уникальной флуоресцентной идентичностью. Тестируемым фрагментам и зондам на шариках микросфер позволяют гибридизоваться друг с другом. После гибридизации микросферы сортируются, обычно с использованием проточной цитометрии . Это позволяет обнаружить каждый из вариантов гена из исходного образца. Собранные в результате данные будут указывать относительное содержание каждого гибридизованного образца в микросфере.
Мультиплексирование
[ редактировать ]Поскольку микросферические шарики легко суспендируются в растворе, и каждая микросфера сохраняет свою идентичность при гибридизации с тестируемым образцом, типичный эксперимент с суспензионной матрицей позволяет анализировать широкий спектр биологических анализов в рамках одной реакции, называемой «мультиплексированием». Как правило, каждый тип микросфер, используемый в массиве, приготавливается отдельно в больших количествах. Например, коммерчески доступные массивы микросфер от Luminex xMAP с технологией используют массив элементов 10X10. В этот массив входят шарики с красными и инфракрасными красителями, каждый из которых имеет десять разных интенсивностей, что дает массив из 100 элементов. [4] Таким образом, размер массива будет увеличиваться экспоненциально, если будет использоваться несколько красителей. Например, пять разных красителей с 10 разной интенсивностью на каждый дадут 100 000 различных элементов массива.
Процедура
[ редактировать ]Пример таргетинга
[ редактировать ]При использовании различных типов микросфер SAT способен одновременно тестировать несколько переменных, таких как ДНК и белки , в данном образце. Это позволяет SAT анализировать различные молекулярные мишени в ходе одной реакции. Обычный метод обнаружения нуклеиновых кислот включает прямую гибридизацию ДНК. Метод прямой гибридизации ДНК представляет собой простейший анализ с использованием суспензионной матрицы, при котором ДНК-олигонуклеотиды длиной от 15 до 20 пар оснований, прикрепленные к микросферам, амплифицируются с помощью ПЦР . Это оптимизированная длина зонда, поскольку она сводит к минимуму изменение температуры плавления различных зондов во время гибридизации зонда и мишени. [1] После амплификации одного интересующего ДНК-олигозонда его можно использовать для создания 100 различных зондов на 100 различных наборах микросфер, каждый из которых способен захватывать 100 потенциальных мишеней (при использовании массива из 100 плексов). Точно так же образцы целевой ДНК обычно с помощью ПЦР . амплифицируются и метятся [4] Гибридизация зонда захвата и ДНК- мишени достигается путем плавления и отжига комплементарных мишени последовательностей ДНК- с зондами захвата, расположенными на микросферах. После промывки для удаления неспецифического связывания между последовательностями только сильно спаренные зонд-мишени останутся гибридизованными. [1]
Сортировка и обнаружение с помощью проточной цитометрии
[ редактировать ]Более подробную информацию по этой теме см. в разделе «Проточная цитометрия».
Поскольку оптическая идентичность каждой микросферы известна, количественная оценка целевых образцов, гибридизованных с микросферами, может быть достигнута путем сравнения относительной интенсивности целевых маркеров в одном наборе микросфер с целевыми маркерами в другом наборе микросфер с использованием проточной цитометрии . Микросферы можно сортировать по их уникальным оптическим свойствам и уровню гибридизации с целевой последовательностью.
Сильные стороны
[ редактировать ]- Быстрая/высокая производительность: при мультиплексном анализе 100-плексный анализ можно анализировать каждые 30 секунд. Недавно сообщалось, что с помощью высокопроизводительной проточной цитометрии можно отбирать образцы из 96-луночного планшета за 1 минуту, и теоретически 100-плексный анализ с помощью этой системы может быть проанализирован менее чем за 1 секунду или потенциально доставить 12 миллионов образцов в день. [4]
- Высокая плотность/мультиплексирование массивов: по сравнению с плоскими микрочипами SAT позволяет выполнять параллельные измерения. Несколько микролитров микросфер могут содержать тысячи элементов массива, и каждый элемент массива представлен сотнями отдельных микросфер. Таким образом, измерение методом проточной цитометрии представляет собой повторный анализ каждого элемента массива. [4]
- Эффективный сбор информации. Одним из преимуществ использования SAT является то, что он позволяет вам взять один образец у пациента или исследуемого организма и одновременно протестировать несколько вариантов генов. Таким образом, по одному образцу можно определить, какой вирус из ряда вирусов имеется у пациента или мутация какой пары оснований присутствует в организме с уникальным фенотипом. [3]
- Экономически эффективно: в настоящее время коммерчески доступные наборы суспензионных матриц стоят 0,10–0,25 доллара США за протестированную последовательность. [1]
Слабые стороны
[ редактировать ]- Относительно небольшой размер массива . Несмотря на потенциал использования большего количества красителей для создания миллионов различных элементов массива, нынешнее поколение коммерчески доступных массивов микросфер (по технологии Luminex xMAP) использует только два набора красителей и, следовательно, может обнаруживать только ~100 мишеней на эксперимент. [4]
- Гибридизация между различными наборами зондов и целевыми последовательностями требует определенной температуры отжига , на которую влияют длина и последовательность олигонуклеотидного зонда. Поэтому для каждого эксперимента можно использовать только одну возможную температуру отжига. Таким образом, все зонды, используемые в данном эксперименте, должны быть рассчитаны на гибридизацию с мишенью при одной и той же температуре. Хотя введение несоответствия пар оснований в некоторых наборах зондов может минимизировать разницу температур отжига между каждым набором зондов, проблема гибридизации по-прежнему остается значительной, если в одной реакции тестируется более 10-20 мишеней. [1]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и Данбар, Шерри А. (2006). «Применение технологии Luminex xMAP для быстрого и высокопроизводительного мультиплексного обнаружения нуклеиновых кислот» . Клиника Химика Акта . 363 (1–2): 71–82. дои : 10.1016/j.cccn.2005.06.023 . ПМК 7124242 . ПМИД 16102740 .
- ^ Зейдеман, Джонатан; Перитт, Дэвид (2002). «Новый метод скрининга моноклональных антител с использованием микросферной системы Luminex-100». Журнал иммунологических методов . 267 (2): 165–171. дои : 10.1016/s0022-1759(02)00168-0 . ПМИД 12165438 .
- ^ Jump up to: а б Данбар, Шерри А.; Вандер Зи, Коу А.; Оливер, Керри Г.; Карем, Кевин Л.; Джейкобсон, Джеймс В. (2003). «Количественное мультиплексное обнаружение бактериальных патогенов: применение ДНК и белков системы Luminex LabMAP». Журнал микробиологических методов . 53 (2): 245–252. дои : 10.1016/S0167-7012(03)00028-9 . ПМИД 12654495 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж Нолан, Джон П.; Склар, Ларри А. (2002). «Технология подвесных решеток: эволюция парадигмы плоской решетки». Тенденции в биотехнологии . 20 (1): 9–12. дои : 10.1016/s0167-7799(01)01844-3 . ПМИД 11742671 .