Идеальное преступление
Идеальное преступление ( Итальянский: [deˈlitto perˈfɛtto] ) — генетический метод in vivo сайт-направленного мутагенеза в дрожжах. Это название в переводе с итальянского означает «идеальное убийство» и относится к способности метода создавать желаемые генетические изменения, не оставляя в геноме чужеродной ДНК .
Фон
[ редактировать ]Этот метод был разработан группой Национального института наук о здоровье окружающей среды (NIEHS) в составе Майкла А. Резника, Франчески Сторичи (сейчас в Технологическом институте Джорджии) и Л. Кевина Льюиса (сейчас в Юго-Западном Техасском государственном университете). В методе используются синтетические олигонуклеотиды в сочетании с клеточным процессом гомологичной рекомбинации . Следовательно, он хорошо подходит для генетических манипуляций с дрожжами, которые обладают высокоэффективной гомологичной рекомбинацией. Подход delitto perfetto использовался для получения одиночных и множественных точечных мутаций, усечения или вставки генов, а также делеций целых генов (включая важные гены).
Преимущества
[ редактировать ]Основным преимуществом этого метода является его способность удалять любую чужеродную ДНК из генома после процесса мутагенеза. не останется селектируемых маркеров Это гарантирует , что в геноме или экзогенных последовательностей, используемых для нацеливания, которые могут вызвать непредвиденные последствия.
Техника delitto perfetto также проще по сравнению с другими методами сайт-направленного мутагенеза in vivo . Другие методы требуют нескольких этапов клонирования и обширного секвенирования ДНК для подтверждения мутагенеза, что часто является сложным и неэффективным процессом. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]
Этот подход обладает большой гибкостью, поскольку после установки кассеты CORE (подробности см. в разделе «Обзор метода») можно легко и быстро произвести множественные мутации в интересующем гене.
Этот метод можно применить к другим организмам, в которых гомологичная рекомбинация эффективна, например к мху Physcomitrella patens , куриным клеткам DT40 или E. coli . Кроме того, человеческие гены можно изучать и аналогичным образом генетически манипулировать дрожжами с использованием искусственных хромосом дрожжей (YAC).
Недостатки
[ редактировать ]Поскольку метод delitto perfetto основан на гомологичной рекомбинации, этот процесс должен быть функциональным в клетках, чтобы метод работал. У Saccharomyces cerevisiae ген RAD52 необходим для гомологичной рекомбинации и, следовательно, необходим для метода delitto perfetto .
Этот метод полезен только для приложений, где нет необходимости в выбираемых маркерах. Например, мутагенизированные штаммы дрожжей не могут быть использованы для дальнейшего генетического анализа, такого как тетрадный анализ. Маркеры придется вставлять в соответствующий локус отдельным процессом.
Технические недостатки
[ редактировать ]- Стоимость олигонуклеотидов
- Мутагенез ограничен областью генома, окружающей вставленную кассету.
- Ограниченное количество репортерных генов (ограничено доступными кассетами CORE)
- Низкая эффективность для некоторых приложений (например, удаление важных генов)
Обзор метода
[ редактировать ]Delitto Perfetto представляет собой двухэтапный метод мутагенеза in vivo . На начальном этапе кассета CORE вставляется в интересующую область путем гомологичной рекомбинации. Впоследствии кассета CORE заменяется ДНК, содержащей интересующую мутацию.
CORE-кассеты
[ редактировать ]Кассета CORE содержит как CO неселектируемый маркер , так и ген-портер RE . Ген-репортер позволяет отбирать дрожжевые клетки, которые получают кассету CORE на первом этапе процесса. Контрселектируемый маркер позволяет отбирать дрожжевые клетки, которые теряют кассету CORE, путем интеграции мутировавшего олигонуклеотида на втором этапе процесса.
На выбор предлагается множество кассет CORE, которые содержат множество репортерных генов, контрселектируемых производителей и дополнительные функции. [ 4 ]
Репортерные гены
[ редактировать ]- kanMX4 – обеспечивает рост в средах, содержащих генетицин.
- hyg – позволяет расти в средах, содержащих гигромицин B.
Встречные маркеры
[ редактировать ]- Kl URA3 – предотвращает рост на средах, содержащих 5-фтороротовую кислоту.
- GAL1/10 -p53 – предотвращает рост на средах, содержащих галактозу . Он кодирует токсичный мутант р53 под промотором GAL1 . [ 5 ]
Дополнительные возможности
[ редактировать ]- GAL1 -I- Sce I – повышает эффективность нацеливания на хромосому, содержащую CORE-кассету, в диплоидных клетках. Он содержит эндонуклеазу рестрикции SceI под промотором GAL1 и целевую последовательность SceI. [ 6 ] [ 7 ]
Рабочий процесс техники
[ редактировать ]Сначала кассета CORE амплифицируется с помощью ПЦР с праймерами, содержащими области гомологии с хромосомным участком, куда она будет вставлена. Кассета CORE интегрируется посредством гомологичной рекомбинации. Клетки, содержащие кассету CORE, могут быть выбраны для использования репортерного гена и могут быть дополнительно подтверждены с использованием контрселектируемого маркера. Интеграцию кассеты CORE в правильном хромосомном положении можно проверить с помощью ПЦР с использованием праймеров, которые отжигаются выше места интеграции, внутри CORE и ниже размера интеграции, которые предназначены для генерации фрагментов размером 500–1500 п.о. [ 4 ]
Дрожжевые клетки, содержащие CORE, трансформируются олигонуклеотидами, содержащими желаемую мутацию, так что они приводят к потере кассеты CORE во время гомологичной рекомбинации. Трансформанты отбираются с использованием контрселектируемого маркера и могут подвергаться дополнительному скринингу с использованием репортерного гена. Секвенирование используется для обеспечения того, чтобы была создана правильная мутация без дополнительных мутаций. Альтернативно, если мутация приводит к образованию или утрате сайта рестрикции, можно использовать ПЦР с последующим рестрикционным расщеплением для подтверждения того, что желаемая мутация была интегрирована. [ 4 ]
Двухцепочечный разрыв (DSB) опосредовал идеальное преступление
[ редактировать ]Чтобы усилить нацеливание олигонуклеотидов на кассету CORE, GAL1 -I- Sce можно использовать кассеты CORE, содержащие признак I. Эта особенность позволяет экспрессировать SceI, эндонуклеазу, которая распознает уникальную последовательность из 18 нуклеотидов, которая вряд ли встретится где-либо еще в геноме S. cerevisiae . Эндонуклеаза SceI способна генерировать DSB в сайте SceI, что приводит к задействованию механизма репарации ДНК . [ 8 ] Это увеличивает частоту направленной гомологичной рекомбинации в 4000 раз по сравнению с тем, когда DSB не генерируется. [ 6 ]
Общие соображения по дизайну олигонуклеотидов
[ редактировать ]Олигонуклеотиды длиной 80–100 п.о. могут быть получены в виде отдельных молекул или пар олигонуклеотидов, которые полностью или частично перекрываются. Рекомендуемый тип олигонуклеотида зависит от типа мутации и расстояния от места интеграции CORE-кассеты, где требуется мутация.
Более длинные олигонуклеотиды приводят к повышению эффективности трансформации. Полностью комплементарные пары олигонуклеотидов приводят к увеличению эффективности в 5–10 раз по сравнению с одиночными олигонуклеотидами и рекомендуются для всех применений. [ 4 ] [ 9 ] Однако они обеспечивают небольшое окно мутагенеза всего в 20–40 оснований из кассеты CORE. Чтобы увеличить окно мутагенеза, можно использовать пары олигонуклеотидов с перекрытием в 20 п.о., которые позволяют нацеливаться на расстояние до 100 п.н. выше и ниже сайта интеграции CORE. Однако они трансформируются примерно в 6 раз менее эффективно. Для повышения эффективности частично перекрывающиеся олигонуклеотиды можно удлинить in vitro . [ 9 ]
Для делеций генов
[ редактировать ]Созданы олигонуклеотиды, содержащие последовательность, расположенную выше по ходу транскрипции, за которой следует последовательность, расположенная ниже по ходу транскрипции от выключаемой области. При делециях генов пары полностью перекрывающихся олигонуклеотидов длиной 80–100 п.н. приводят к 5–10-кратному увеличению эффективности трансформации, чем одиночные олигонуклеотиды. [ 4 ]
Для точечных мутаций
[ редактировать ]Для мутаций от 20 до 40 п.о. от кассеты CORE рекомендуются полностью перекрывающиеся олигонуклеотиды длиной 80–100 п.н. Для мутаций длиной более 40 п.о. от кассеты CORE необходимо использовать частично перекрывающиеся олигонуклеотиды. Для повышения эффективности их трансформации рекомендуется удлинять частично перекрывающиеся олигонуклеотиды in vitro . [ 4 ] [ 6 ] [ 9 ]
Для важных генов
[ редактировать ]Для создания мутантов основных генов кассету CORE можно вставить ниже интересующего гена, однако это ограничивает области гена, доступные для мутации. Альтернативно можно использовать диплоидные клетки. Однако использование диплоида снижает эффективность нацеливания на олигонуклеотиды из-за наличия двух подходящих хромосомных участков для рекомбинации олигонуклеотидов. Чтобы устранить этот недостаток, можно использовать метод delitto perfetto, опосредованный DSB. Это увеличивает частоту направленной гомологичной рекомбинации в 700 раз по сравнению с ситуацией, когда DSB не генерируется. При этом он в 2–5 раз эффективнее других доступных методов. [ 6 ] [ 9 ]
Частота фоновых мутаций
[ редактировать ]Сообщается, что когда двухцепочечные разрывы не образуются, количество клеток, теряющих кассету CORE в отсутствие нацеливающего олигонуклеотида, составляет менее одного трансформанта на 10. 7 жизнеспособные клетки. Напротив, это число увеличивается до 100 трансформантов на 10 7 жизнеспособные клетки, когда образуется двухцепочечный разрыв. У диплоида повышенная частота фоновых мутаций происходит из-за гомологичной рекомбинации, при которой гомологичная хромосома снижает количество событий целевой трансформации до только 4% от общего числа трансформантов. [ 6 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Эрдениз Н., Мортенсен У.Х., Ротштейн Р. (1997)Методы замены аллелей на основе ПЦР без клонирования. Геном Рез. 7:1174-83.
- ^ Лангле-Руо Ф., Джейкобс Э. (1995) Метод точного изменения генома дрожжей с использованием перерабатываемого селектируемого маркера. Нуклеиновые кислоты Рез. 23:3079-81.
- ^ Шерер С., Дэвис Р.В. (1979)Замена сегментов хромосом измененными последовательностями ДНК, сконструированными in vitro . Proc Natl Acad Sci. 76:4951-5.
- ^ Jump up to: а б с д и ж Сторичи Ф., Резник М.А. (2006)Подход delitto perfetto к сайт-направленному мутагенезу и перестройкам хромосом in vivo с использованием синтетических олигонуклеотидов в дрожжах. Методы Энзимол. 409:329-45.
- ^ Инга А., Резник М.А. (2001)Новые мутации р53 человека, токсичные для дрожжей, могут усиливать трансактивацию специфических промоторов и реактивных опухолевых мутантов р53. Онкоген. 14;20(27):3573-9
- ^ Jump up to: а б с д и Сторичи Ф., Дарем К.Л., Горденин Д.А., Резник М.А. (2003)Хромосомные сайт-специфические двухцепочечные разрывы эффективно подвергаются репарации с помощью олигонуклеотидов в дрожжах. Proc Natl Acad Sci. 9;100(25):14994-9
- ^ Плессис А., Перрин А., Хабер Дж., Дужон Б. (1992) Сайт-специфическая рекомбинация, определяемая I-SceI, эндонуклеазой, кодируемой интроном митохондриальной группы I, экспрессируемой в ядре дрожжей. Генетика. 130(3):451-60
- ^ Историки Ф., Резник М.А. (2003)Направленный мутагенез Delitto Perfection в дрожжах с помощью олигонуклеотидов. Генет англ 25:189-207
- ^ Jump up to: а б с д Сторичи Ф., Льюис Л.К., Резник М.А. (2001)Сайт-направленный мутагенез in vivo с использованием олигонуклеотидов. Нат Биотехнология. 19(8):773-6