Микроматрица обращенно-фазового белкового лизата

Микрочип белкового лизата обращенной фазы ( RPMA ) представляет собой белковый микрочип, разработанный в виде дот-блот высококачественные антитела . -платформы, который позволяет измерять уровни экспрессии белка в большом количестве биологических образцов одновременно количественным способом, когда доступны

Технически, мизерные количества (а) клеточных лизатов из интактных клеток или микродиссекированных клеток, захватываемых лазером, (б) жидкостей организма, таких как сыворотка, спинномозговая жидкость, моча, стекловидное тело, слюна и т. д., иммобилизуются на отдельных участках микроматрицы , которая представляет собой затем инкубировали с одним специфическим антителом для обнаружения экспрессии целевого белка во многих образцах. Доступно краткое видео о RPPA. Один микрочип, в зависимости от конструкции, может вместить от сотен до тысяч образцов, которые печатаются в серии повторов. Обнаружение проводят с использованием первичных или вторично меченных антител с помощью хемилюминесцентных , флуоресцентных или колориметрических анализов. Затем массив визуализируется и полученные данные оцениваются количественно.

Мультиплексирование достигается путем одновременного зондирования нескольких массивов, покрытых одним и тем же лизатом, разными антителами, и может быть реализовано как количественный калиброванный анализ. Кроме того, поскольку RPMA может использовать лизаты цельных, нерасчлененных или микрорассеченных клеток, он может предоставить прямую количественную информацию о посттрансляционно модифицированных белках, которые недоступны с помощью других высокопроизводительных методов. Таким образом, RPMA предоставляет многомерные протеомные данные с высокой пропускной способностью, чувствительностью и количественным подходом. Однако, поскольку сигнал, генерируемый RPMA, может быть получен в результате связывания неспецифического первичного или вторичного антитела, как это видно в других методах, таких как ELISA или иммуногистохимия, сигнал из одного пятна может быть обусловлен перекрестной реактивностью . Таким образом, антитела, используемые в RPMA, должны быть тщательно проверены на специфичность и эффективность в отношении клеточных лизатов с помощью вестерн-блоттинга .

RPMA имеет различные применения, такие как количественный анализ экспрессии белка в раковых клетках, жидкостях организма или тканях для определения профиля биомаркеров , анализа клеточных сигналов и клинического прогноза, диагностики или терапевтического прогнозирования. Это возможно, поскольку можно сконструировать RPMA с лизатами из разных клеточных линий и/или с помощью лазерного захвата микродиссекционных биопсий тканей разных стадий заболевания из разных органов одного или многих пациентов для определения относительной или абсолютной численности или дифференциальной экспрессии уровня белковых маркеров в организме. единственный эксперимент. Он также используется для мониторинга динамики белка в ответ на различные стимулы или дозы лекарств в различные моменты времени. Некоторые другие приложения, для которых используется RPMA, включают исследование и картирование сигнальных путей белков, оценку молекулярных мишеней лекарств и понимание механизма действия потенциального лекарства. Его также предлагали в качестве потенциального раннего скринингового теста у онкологических больных, чтобы облегчить или направить принятие терапевтических решений.

Другие белковые микрочипы включают прямые белковые микрочипы (PMA) и микрочипы антител (AMA). PMA иммобилизуют на микрочипе отдельные очищенные, а иногда и денатурированные рекомбинантные белки, которые проверяются антителами и другими небольшими соединениями. АМА иммобилизуют антитела, которые захватывают аналиты из образца, нанесенного на микрочип. Целевой белок выявляют либо путем прямого мечения, либо с помощью вторично меченного антитела против другого эпитопа целевого белка анализируемого вещества (сэндвич-подход). И PMA, и AMA можно классифицировать как массивы прямой фазы, поскольку они включают иммобилизацию приманки для захвата аналита. В массивах прямой фазы каждый массив инкубируется с одним тестируемым образцом, например клеточным лизатом или сывороткой пациента, но одновременно тестируются несколько аналитов в образце. На рисунке 1 показаны белковые микрочипы прямой (с использованием антител в качестве приманки) и обратной фазы на молекулярном уровне.

Схема и процедура эксперимента

В зависимости от вопроса исследования или типа и цели исследования, RPMA может быть разработан путем выбора содержимого массива, количества образцов, размещения образцов в микропланшетах, компоновки массива, типа микрочипа, правильного детектирующего антитела, сигнала метод обнаружения, включение контроля и контроля качества проб. Затем реальный эксперимент проводится в лаборатории, а полученные результаты количественно оцениваются и анализируются. Этапы эксперимента перечислены ниже:

Коллекция образцов

Клетки выращивают в колбах Т-25 при 37 градусах и 5% CO ₂ в соответствующей среде. В зависимости от плана исследования, после слияния клеток их можно обработать лекарствами, факторами роста или облучить перед этапом лизиса. Для временных исследований в набор колб одновременно добавляют стимулятор, а затем колбы обрабатывают в разные моменты времени. Для исследования дозы лекарственного средства набор колб обрабатывают разными дозами лекарственного средства и все колбы собирают одновременно.

Если необходимо получить RPMA, содержащий лизаты клеточных фракций ткани/тканей, лазерной микродиссекции (LCM) или тонкоигольной аспирации . для микроскопического выделения определенных клеток из области ткани используются методы

Лизис клеток

Осадки клеток, собранные любым из вышеперечисленных способов, лизируют буфером для лизиса клеток для получения высокой концентрации белка.

Скрининг антител

Аликвоты лизатов объединяют и разделяют с помощью двумерного однодорожечного электрофореза в ДСН-ПААГ с последующим вестерн-блоттингом на нитроцеллюлозной мембране. Мембрану разрезают на четырехмиллиметровые полоски, и каждую полоску исследуют разными антителами. Полоски с одной полосой указывают на специфические антитела, подходящие для использования RPMA. Эффективность антител также должна быть подтверждена с использованием выборки меньшего размера в идентичных условиях перед фактическим сбором проб для RPMA.

Строительство РПМА

Клеточные лизаты собирают и серийно разводят в шесть-десять раз, если используют колориметрические методы, или без разведения, когда используется флуорометрическое обнаружение (из-за большего динамического диапазона флуоресценции, чем колориметрическое обнаружение). Затем серийные разведения в повторах высевают на 384- или 1536-луночный микротитровальный планшет. Затем лизаты наносятся на предметные стекла, покрытые мембраной из нитроцеллюлозы или ПВДФ, с помощью микрочипа, такого как Aushon BioSystem 2470 или робота Flexys (Genomic Solution). Aushon 2470 с системой твердых штифтов является идеальным выбором, поскольку его можно использовать для получения матриц с очень вязкими лизатами, а также имеется контроль влажности и автоматизированная система подачи слайдов. При этом есть опубликованные статьи, показывающие, что печатные штифты Arrayit Microarray также можно использовать и производить микрочипы с гораздо более высокой производительностью с использованием меньшего количества лизата. Предметные стекла с мембранным покрытием коммерчески доступны от нескольких различных компаний, таких как Schleicher и Schuell Bioscience (теперь принадлежащие GE Whatman www.whatman.com), Grace BioLabs (www.gracebio.com), Thermo Scientific и SCHOTT Nexterion (www.schott.com/nexterion).

Обнаружение иммунохимического сигнала

После печати слайдов неспецифические сайты связывания на матрице блокируются с использованием блокирующего буфера, такого как I-Block, и массивы исследуются первичным антителом, а затем вторичным антителом. Обнаружение обычно проводится с помощью системы усиления сигнала, катализируемой DakoCytomation (CSA). Для усиления сигнала предметные стекла инкубируют с комплексом стрептавидин-биотин-пероксидаза, затем биотинилтирамид/перекись водорода и стрептавидин-пероксидаза. Проявку завершают с использованием перекиси водорода и получают сканы слайдов (1). Усиление сигнала тирамида работает следующим образом: иммобилизованная пероксидаза хрена (HRP) превращает тирамид в реактивное промежуточное соединение в присутствии перекиси водорода. Активированный тирамид связывается с соседними белками вблизи места связывания активирующего фермента HRP. Это приводит к отложению большего количества молекул тирамида в этом месте; отсюда и усиление сигнала.

Лэнс Лиотта и Эмануаль Петрикоин изобрели метод RPMA в 2001 году (см. раздел истории ниже) и разработали метод мультиплексного обнаружения с использованием флуоресцентных методов ближнего инфракрасного диапазона. В этом исследовании они сообщают об использовании подхода на основе двойного красителя, который может эффективно удвоить количество конечных точек, наблюдаемых на массиве, позволяя, например, одновременно измерять и анализировать уровни фосфоспецифического и общего белка.

Количественная оценка и анализ данных

После проведения иммуноокрашивания необходимо количественно оценить экспрессию белка. Уровни сигналов можно получить, используя отражательный режим обычного оптического планшетного сканера, если использовать колориметрический метод обнаружения. или с помощью лазерного сканирования, например, с помощью системы TECAN LS, если используются флуоресцентные методы. Две программы, доступные онлайн (P-SCAN и ProteinScan), можно использовать для преобразования отсканированного изображения в числовые значения. Эти программы количественно определяют интенсивность сигнала в каждой точке и используют алгоритм интерполяции дозы (DI ₂₅ ) для вычисления одного нормализованного значения уровня экспрессии белка для каждого образца. Нормализация необходима для учета различий в общей концентрации белка между каждым образцом и для того, чтобы можно было напрямую сравнивать окрашивание антителами между образцами. Этого можно достичь, проведя параллельный эксперимент, в котором общие белки окрашивают с помощью окрашивания общего белка коллоидным золотом или окрашивания общего белка Sypro Ruby . При анализе нескольких RPMA значения интенсивности сигнала могут отображаться в виде тепловой карты, что позволяет проводить байесовский кластерный анализ и профилировать сигнальные пути. Оптимальный программный инструмент, специально разработанный для RPMA, называется Microvigene от Vigene Tech, Inc.

Сильные стороны

Самым большим преимуществом RPMA является то, что они позволяют осуществлять высокопроизводительное, мультиплексное и сверхчувствительное обнаружение белков из чрезвычайно малого количества входного материала, что невозможно сделать с помощью обычного вестерн-блоттинга или ИФА . Небольшой размер пятна на микрочипе (диаметр от 85 до 200 микрометров) позволяет анализировать тысячи образцов с одним и тем же антителом в одном эксперименте. RPMA обладают повышенной чувствительностью и способны обнаруживать белки в диапазоне пикограмм. Некоторые исследователи даже сообщили об обнаружении белков в диапазоне аттограмм. Это значительное улучшение по сравнению с обнаружением белка с помощью ИФА , для которого требуется количество белка в микрограммах (6). Увеличение чувствительности РПМА обусловлено миниатюрным форматом решетки, что приводит к увеличению плотности сигнала (интенсивность сигнала/площадь). в сочетании с усилением отложения тирамида. Высокая чувствительность RPMA позволяет обнаруживать белки или биомаркеры с низким содержанием , такие как фосфорилированные сигнальные белки, из очень небольших количеств исходного материала, такого как образцы биопсии , которые часто контаминированы нормальной тканью. Используя лазерный захват, микродиссекционные лизаты можно анализировать всего из 10 клеток. при этом каждое пятно содержит менее одной сотой клеточного эквивалента белка.

Большим преимуществом RPMA по сравнению с традиционными белковыми массивами прямой фазы является уменьшение количества антител, необходимых для обнаружения белка. В белковых матрицах прямой фазы обычно используется сэндвич-метод для захвата и обнаружения желаемого белка. Это означает, что на белке должно быть два эпитопа (один для захвата белка и один для обнаружения белка), для которых доступны специфические антитела. Другие белковые микроматрицы прямой фазы непосредственно метят образцы, однако часто существует вариабельность эффективности мечения для разных белков, и часто мечение разрушает эпитоп, с которым связывается антитело. Эта проблема решается с помощью RPMA, поскольку образец не нужно маркировать напрямую.

Еще одним преимуществом RPMA по сравнению с белковыми микрочипами прямой фазы и вестерн-блоттингом является единообразие результатов, поскольку все образцы на чипе исследуются одними и теми же первичными и вторичными антителами и одинаковой концентрацией реагентов для амплификации в течение одного и того же периода времени. Это позволяет количественно оценить различия в уровнях белка во всех образцах. Кроме того, печать каждого образца на чипе в серийном разведении (колориметрическом) обеспечивает внутренний контроль, гарантирующий выполнение анализа только в линейном динамическом диапазоне анализа. В оптимальном случае печать калибраторов, а также контролей высокого и низкого уровня непосредственно на одном чипе обеспечит непревзойденную возможность количественного измерения каждого белка с течением времени и между экспериментами. Проблема, с которой сталкиваются при использовании тканевых микрочипов, — это поиск антигена и присущая иммуногистохимии субъективность. Антитела, особенно фосфоспецифичные реагенты, часто обнаруживают линейные пептидные последовательности, которые могут быть замаскированы из-за трехмерной конформации белка. Эта проблема решается с помощью RPMA, поскольку образцы можно денатурировать, обнаруживая любые скрытые эпитопы.

Слабые стороны

Самым большим ограничением RPMA, как и всех иммуноанализов, является его зависимость от антител для обнаружения белков. В настоящее время существует ограниченное, но быстро растущее число сигнальных белков, к которым существуют антитела, дающие анализируемый сигнал. Кроме того, поиск подходящего антитела может потребовать тщательного скрининга многих антител с помощью вестерн-блоттинга перед началом анализа RPMA. Чтобы решить эту проблему, были созданы две базы данных с открытыми ресурсами для отображения результатов вестерн-блоттинга для антител, которые имеют хорошую специфичность связывания в ожидаемом диапазоне. Кроме того, RPMA, в отличие от вестерн-блоттинга, не разделяют белковые фракции по молекулярной массе. Таким образом, крайне важно провести предварительную проверку антител.

История

Впервые RPMA была представлена ​​в 2001 году в статье Ланса Лиотты и Эмануэля Петрикона, которые изобрели эту технологию. Авторы использовали эту технику для успешного анализа состояния белка контрольной точки, способствующего выживанию, на микроскопической переходной стадии с использованием микродиссекции лазерного захвата гистологически нормального эпителия простаты, интраэпителиальной неоплазии простаты и совместимого с пациентом инвазивного рака простаты. С тех пор RPMA использовался во многих фундаментальных биологических, трансляционных и клинических исследованиях. Кроме того, этот метод впервые прошел клинические испытания, в ходе которых пациенты с метастатическим колоректальным раком и раком молочной железы выбираются для лечения на основе результатов RPMA. Этот метод был коммерциализирован для персонализированных медицинских приложений компанией Theranostics Health, Inc.

Внешние ссылки

• http://www.bio-itworld.com/BioIT_Article.aspx?id=97660
• http://discover.nci.nih.gov/abminer