Лазерная микродиссекция захвата
Микродиссекция с лазерным захватом ( LCM ), также называемая микродиссекцией , лазерной микродиссекцией ( LMD ) или микродиссекцией с помощью лазера ( LMD или LAM ), представляет собой метод выделения конкретных клеток представляющих интерес из микроскопических областей ткани /клеток/ организмов. [1] [2] ( диссекция в микроскопическом масштабе с помощью лазера ) .
Принцип
[ редактировать ]Микродиссекция с лазерным захватом (LCM) — это метод получения субпопуляций тканевых клеток под прямой микроскопической визуализацией. Технология LCM позволяет собирать интересующие клетки напрямую или изолировать определенные клетки путем удаления нежелательных клеток с получением гистологически чистых обогащенных популяций клеток. Существует множество последующих приложений: генотипирование ДНК и анализ потери гетерозиготности (LOH), транскриптов РНК профилирование , создание библиотеки кДНК , открытие протеомики и профилирование сигнальных путей. Общее время, необходимое для выполнения этого протокола, обычно составляет 1–1,5 часа. [3]
Добыча
[ редактировать ]Лазер . подключен к микроскопу и фокусируется на ткани на предметном стекле Путем перемещения лазера по оптике или предметному столику фокус следует по траектории, заданной пользователем. Эту траекторию, также называемую элементом , затем вырезают и отделяют от прилегающей ткани. Если процесс экстракции желателен, после процесса резки должен следовать процесс экстракции. Более поздние технологии используют бесконтактную микродиссекцию.
Существует несколько способов извлечения ткани из предметного стекла микроскопа с образцом гистопатологии на нем. Прижмите липкую поверхность к образцу и вырвите его. При этом извлекается нужная область, но также можно удалить частицы или нежелательные ткани на поверхности, поскольку поверхность не является селективной. Расплавьте пластиковую мембрану на образце и вырвите ее. Тепло подается, например, с помощью красного или инфракрасного (ИК) лазера на мембрану, окрашенную поглощающим красителем. Поскольку при этом желаемый образец прикрепляется к мембране, как и в случае с любой другой мембраной, расположенной близко к поверхности гистопатологического образца, может быть извлечено некоторое количество мусора. Другая опасность заключается в привнесении тепла: некоторые молекулы, такие как ДНК, РНК или белок, не допускают слишком сильного нагрева или вообще не допускают нагревания с целью максимально чистой изоляции.
Для бесконтактной перевозки. Есть три разных подхода. Транспортировка под действием силы тяжести с использованием вертикального микроскопа (так называемая GAM, гравитационная микродиссекция ) или транспортировка с помощью катапульты лазерного давления ; в самом последнем поколении используется технология, основанная на прямом переносе, индуцированном лазером (LIFT). При методе вырезания и захвата колпачок, покрытый клеем, помещается непосредственно на тонко разрезанный (5-8 мкм) срез ткани, причем сам срез опирается на тонкую мембрану (полиэтиленнафталин). ИК-лазер мягко нагревает клей на колпачке, приклеивая его к подлежащей ткани, а УФ-лазер прорезает ткань и подлежащую мембрану. Мембранно-тканевый объект теперь прикрепляется к колпачку, и клетки на колпачке можно использовать в последующих приложениях (анализ ДНК, РНК, белков). [4]
Процедура
[ редактировать ]
Под микроскопом с использованием программного интерфейса просматривается срез ткани (обычно толщиной 5–50 микрометров) и идентифицируются отдельные клетки или кластеры клеток либо вручную, либо полуавтоматическими, либо более полностью автоматизированными способами, позволяющими визуализировать, а затем автоматически выбирать цели для изоляции. В настоящее время существует шесть основных технологий выделения/сбора с использованием микроскопа и устройства для выделения клеток. Четыре из них обычно используют импульсный ультрафиолетовый лазер (355 нм) для непосредственного разрезания тканей или мембран/пленки, а иногда и в сочетании с ИК- лазером, ответственным за нагрев/плавление липкого полимера для клеточной адгезии и изоляции. ИК-лазер обеспечивает более щадящий подход к микродиссекции. Пятая технология, основанная на ультрафиолетовом лазере, использует специальные предметные стекла, покрытые энергопередающим покрытием, которое при активации лазерным импульсом перемещает ткань или клетки в колпачок для сбора.
Ширина лазерной резки обычно составляет менее 1 мкм, поэтому лазерный луч не воздействует на клетки-мишени. Даже живые клетки не повреждаются лазерной резкой и остаются жизнеспособными после резки для клонирования и повторного культивирования при необходимости. [5]
Различные технологии различаются процессом сбора, возможными методами визуализации ( флуоресцентная микроскопия / светлопольная микроскопия / дифференциально-интерференционно-контрастная микроскопия / фазово-контрастная микроскопия и т. д.), а также типами держателей и подготовкой тканей, необходимой перед визуализацией и изоляцией. Большинство из них в основном представляют собой специализированные системы микродиссекции, а некоторые также могут использоваться в качестве исследовательских микроскопов. Только одна технология (№2 здесь, Leica) использует вертикальный микроскоп, что несколько ограничивает некоторые возможности работы с образцами, особенно для работы с живыми клетками.
Первая технология (используемая Carl Zeiss PALM) разрезает образец, а затем собирает его с помощью «катапультирующей» технологии. Образец можно катапультировать с предметного стекла или специальной культуральной чашки с помощью расфокусированного УФ-лазерного импульса, который генерирует фотонную силу, чтобы вытолкнуть материал со предметного стекла/чашки. Этот метод иногда называют катапультированием под давлением лазерной микродиссекции (LMPC). Рассеченный материал направляется вверх (до нескольких миллиметров) в крышку микроцентрифужной пробирки или другой коллектор, который содержит либо буфер, либо специальный липкий материал в крышке пробирки, к которому будет прилипать ткань. Этот активный процесс катапультирования позволяет избежать некоторых статических проблем при использовании предметных стекол с мембранным покрытием. [6]
Другой процесс основан на методе гравитационной микродиссекции, который включает гравитацию для сбора образцов в крышку пробирки под используемым предметным стеклом (используется системой ION LMD , Jungwoo F&B). В случае этой системы она перемещает моторизованный столик, чтобы разрезать интересующие клетки, удерживая лазерный луч неподвижным. В системе используется твердотельный лазер с длиной волны 355 нм ( УФ-А ), который является самым безопасным способом разрезания тканей без повреждения РНК или ДНК. [7] [ не удалось пройти проверку ]
Другой тесно связанный процесс LCM (используемый Leica) разрезает образец сверху, и образец падает под действием силы тяжести (микродиссекция под действием силы тяжести) в устройство захвата под образцом. [8] В отличие от верхней точки, лазерный луч здесь движется, разрезая ткань, перемещая дихроичное зеркало.
Когда выбранные клетки (на предметном стекле или специальной культуральной чашке) находятся в центре поля зрения, оператор выбирает интересующие клетки с помощью программного обеспечения прибора. Область, которую необходимо изолировать, когда лазер ближнего ИК-диапазона активирует переносную пленку на колпачке, помещенном на образец ткани, плавя клей, который затем сплавляет пленку с выбранными нижележащими клетками (см. системы Arcturus); и/или активируя УФ-лазер, чтобы вырезать интересующую клетку. Затем клетки отделяют от тонкого среза ткани, оставляя все нежелательные клетки. Затем интересующие клетки просматриваются и документируются перед экстракцией. [9]
Четвертая технология, основанная на УФ-излучении (используемая Molecular Machines and Industries AG), предлагает небольшое отличие от третьей технологии, поскольку по существу создает своего рода сэндвич со слайдом>образцом> и мембраной, находящейся над образцом, с использованием предметного стекла в рамке, поверхность мембраны которого разрезается лазером и в конечном итоге захватывается сверху специальной клейкой крышкой. [10]
Пятая технология, основанная на УФ-излучении, использует стандартные предметные стекла, покрытые инертным покрытием, передающим энергию, и систему лазерной микродиссекции на основе УФ-излучения (обычно аппарат Leica LMD или PALM Zeiss). Срезы ткани крепятся поверх энергопередающего покрытия. Энергия УФ-лазера преобразуется в кинетическую энергию при воздействии на покрытие, испаряя его и мгновенно перемещая выбранные элементы ткани в пробирку для сбора. Слайды с покрытием для передачи энергии, выпускаемые под торговой маркой DIRECTOR слайды компанией Expression Pathology Inc. (Роквилл, Мэриленд), предлагают несколько преимуществ для протеомных исследований. Они также не автофлуоресцируют, поэтому их можно использовать для окрашивания флуоресцентными красками, ДИК или поляризованного света. [11]
Помимо срезов тканей, LCM можно проводить на живых клетках/организмах, мазках клеток, препаратах хромосом и тканях растений.
Приложения
[ редактировать ]Процесс микродиссекции с лазерным захватом не изменяет и не повреждает морфологию и химический состав собранного образца, а также окружающих клеток. По этой причине LCM является полезным методом сбора выбранных клеток для анализа ДНК , РНК и/или белков . LCM также использовался для выделения бесклеточных структур, таких как амилоидные бляшки . [12] LCM может быть выполнен на различных образцах тканей , включая мазки крови , цитологические препараты, [13] клеточные культуры и аликвоты твердых тканей. Также можно использовать замороженные и залитые парафином архивные ткани. [14]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Эммерт-Бак М.Р., Боннер Р.Ф., Смит П.Д., Чуаки Р.Ф., Чжуан З., Гольдштейн С.Р., Вайс Р.А., Лиотта Л.А. (1996). «Лазерная захватная микродиссекция». Наука . 274 (5289): 998–1001. Бибкод : 1996Sci...274..998E . CiteSeerX 10.1.1.462.2914 . дои : 10.1126/science.274.5289.998 . ПМИД 8875945 . S2CID 32921237 .
- ^ Эспина В., Хейби М., Пьеробон М., Лиотта Л.А. (2007). «Технология лазерного захвата микродиссекции». Эксперт преподобный мол. Диагностика . 7 (5): 647–57. дои : 10.1586/14737159.7.5.647 . ПМИД 17892370 . S2CID 46548538 .
- ^ Эспина В., Вульфхуле Дж.Д., Калверт В.С., ВанМетер А., Чжоу В., Кукос Г., Гехо Д.Х., Петрикоин III EF, Лиотта Л.А. (01 июля 2006 г.). «Лазерно-захватная микродиссекция». Протоколы природы . 1 (2): 586–603. CiteSeerX 10.1.1.462.2914 . дои : 10.1038/нпрот.2006.85 . ISSN 1754-2189 . ПМИД 17406286 . S2CID 1134441 .
- ^ Персонал. «Оптимизированный протокол крепления срезов тканей на предметные стекла PEN-мембраны в металлическом каркасе (Протокол № 9)» (PDF) . Оборудование БМ . Арктурус Бионаука. PN 14191-00 Ред. А. Проверено 19 февраля 2016 г.
- ^ Персонал. «Общие часто задаваемые вопросы о MMI CellCut Plus/MMI SmartCut Plus» . Молекулярные машины и промышленность. Повредит ли лазер окружающие ткани? Архивировано из оригинала 12 февраля 2013 года.
- ^ «Лазерная микродиссекция и катапультирование под давлением (LMPC)» . Центр клеточной визуализации (CCI) . Университет Гетеборга. 25 ноября 2010 года . Проверено 27 октября 2011 г.
- ^ «Зачем прописывать ACUVUE?» . 23 июня 2017 г.
- ^ «Центр конфокальной визуализации» . КУ Медицинский центр. Архивировано из оригинала 11 июля 2011 года . Проверено 28 октября 2011 г.
- ^ «ЛКМ» . joepham004. 19 мая 2008 г. Архивировано из оригинала 19 декабря 2021 г. Проверено 27 июня 2012 г.
- ^ «Лазерная микродиссекция с системой MMI» . Молекулярные машины и промышленность АГ. 9 мая 2012 г. Архивировано из оригинала 19 декабря 2021 г. Проверено 27 июня 2012 г.
- ^ «Методы подтяжки тонких пленок» . веб.пси. Архивировано из оригинала 25 апреля 2012 года . Проверено 27 июня 2012 г.
- ^ Ларошель С. (декабрь 2015 г.). «Топать по битам». Природные методы . 12 (12): 1114. doi : 10.1038/nmeth.3679 . ПМИД 26962581 . S2CID 42051029 . ( требуется регистрация )
- ^ Орба Ю, Танака С, Нишихара Х, Кавамура Н, Ито Т, Симидзу М, Сава Х, Нагасима К (2003). «Применение лазерной микродиссекции захвата цитологических образцов для обнаружения перестройки генов тяжелой цепи иммуноглобулина у пациентов со злокачественными лимфомами» . Рак . 99 (4): 198–204. дои : 10.1002/cncr.11331 . ПМИД 12925980 .
- ^ Кихара А.Х., Морискот А.С., Феррейра П.Дж., Хамассаки Д.Э. (2005). «Защита РНК в фиксированной ткани: альтернативный метод для пользователей LCM». J Неврологические методы . 148 (2): 103–7. doi : 10.1016/j.jneumeth.2005.04.019 . ПМИД 16026852 . S2CID 20606196 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Университет Восточной Каролины: LCM для «чайников»
- Проект Йельского атласа транскрипции риса с использованием микродиссекции лазерного захвата
