Микроноситель
Микроноситель — это опорная матрица, позволяющая расти прикрепившимся клеткам в биореакторах . Вместо плоской поверхности клетки культивируются на поверхности сферических микроносителей, так что каждая частица несет в себе несколько сотен клеток, и, следовательно, способность к расширению может быть увеличена в несколько раз. [1] Он обеспечивает простой способ масштабирования культуральных систем для промышленного производства клеточной или белковой терапии или для исследовательских целей. [2] [3]
Эти твердые или пористые сферические матрицы имеют диаметр от 100 до 300 мкм, что обеспечивает достаточную площадь поверхности, сохраняя при этом достаточную адгезию и поддержку клеток, а их плотность минимально превышает плотность воды (1 г/мл), поэтому они остаются в суспензии в резервуар с мешалкой. [1] [4] Они могут состоять как из синтетических материалов, таких как акриламид, так и из натуральных материалов, таких как желатин. [2] [3]
Преимущества технологии микроносителей в биотехнологической промышленности включают (а) простоту масштабирования, (б) возможность точно контролировать условия роста клеток в сложных биореакторах с компьютерным управлением, (в) общее сокращение площади и объема инкубатора. необходимые для производственной операции заданного размера, (г) резкое сокращение технического труда и (д) более естественная среда для клеточной культуры, которая способствует дифференцировке. [5]
Состав микроносителя
[ редактировать ]Синтетические и натуральные микроносители
[ редактировать ]Можно использовать несколько типов микроносителей, выбор которых имеет решающее значение для оптимальной производительности приложения. На ранних этапах развития микроносителей в подавляющем большинстве использовались синтетические материалы, поскольку они позволяли легко контролировать механические свойства и воспроизводить результаты для оценки их характеристик. [3] К таким материалам относятся DEAE-декстран, стекло, полистирольный пластик и акриламид . [3] В 1967 году разработка микроносителей началась, когда ван Везель обнаружил, что материал может поддерживать рост клеток, зависимых от закрепления, и использовал микроносители диэтиламиноэтил-сефадекс. [3] Однако синтетические полимеры предотвращают достаточное взаимодействие клеток с окружающей средой и замедляют их рост. [4] Клетки могут не дифференцироваться должным образом без обратной связи с окружающей средой, а уровень привязанности будет низким. [3] Поэтому второе поколение разработки микроносителей предполагает использование природных полимеров, таких как желатин , коллаген , хитин и его производные, а также целлюлоза . [2] Эти материалы не только легко получить, но и природные материалы обеспечивают места прикрепления клеток и аналогичное микроокружение, которое обеспечивает клеточные сигнальные пути, необходимые для их правильной дифференцировки. [3] Кроме того, поскольку они биосовместимы, полученную суспензию можно использовать для клеточной терапии in vivo . [1]
Твердые и пористые микроносители
[ редактировать ]Хотя были разработаны жидкие микроносители, подавляющее большинство коммерчески доступных микроносителей представляют собой твердые частицы, синтезированные посредством суспензионной полимеризации . [3] Однако клетки, выращенные на твердых микроносителях, рискуют повредиться от внешних сил и столкновений с другими частицами и резервуаром. [4] Поэтому необходимо принять дополнительные меры предосторожности при определении скорости и механизма перемешивания, чтобы возникающие в результате гидродинамические силы не были достаточно сильными, чтобы отрицательно повлиять на культуру. [4] [3] Разработка пористых микроносителей значительно расширила возможности этой технологии, поскольку она еще больше увеличила количество клеток, которые может удерживать материал, но, что более важно, она защитила клетки внутри частицы от внешних сил. [3] К ним относятся сопротивления и силы трения суспензионной жидкости, градиенты давления и напряжения сдвига . [1] 1980-е годы ознаменовались волной развития микроносителей с появлением пористых частиц. [4]
Модификации поверхности
[ редактировать ]Микроносители из одного и того же материала могут различаться по пористости, удельному весу , оптическим свойствам, присутствию животных компонентов и химическому составу поверхности. [4] Химический состав поверхности может включать белки внеклеточного матрикса, функциональные группы , рекомбинантные белки, пептиды и положительно или отрицательно заряженные молекулы, добавленные посредством конъюгации , сополимеризации , обработки плазмой или прививки. [3] Помимо прочего, они могут служить для обеспечения более высоких уровней прикрепления клеток к частицам, обеспечения контролируемого высвобождения для изоляции или повышения термической и физической устойчивости частиц. [3]
Коммерчески доступны несколько типов микроносителей, включая микроносители на основе альгината (GEM, Global Cell Solutions), декстрана (Cytodex, GE Healthcare ), коллагена (Cultispher, Percell) и микроносителей на основе полистирола (SoloHill Engineering). [5]
| Имя | Размер (мкм) | Плотность (г/мл) | Материал |
|---|---|---|---|
| Цитодекс-1 | 60–87 | 1.03 | Декстрановая матрица с положительно заряженными диэтиламиноэтильными группами по всей матрице |
| Цитодекс-2 | 60–87 | 1.04 | Декстрановая матрица с N , N , N -триметил-2-гидроксиаминопропильными группами |
| Цитодекс-3 | 60–87 | 1.04 | Декстрановые гранулы, покрытые денатурированным коллагеном свиной кожи, прикрепленным к поверхности. |
| Цитопор 1 | 200–280 | 1.03 | Целлюлоза |
| КультиСфера G | 130–380 | 1.04 | Сшитый свиной желатин |
| КультиСфера S | 130–380 | 1.04 | Сшитый свиной желатин |
| Хиллекс | 150–210 | 1.1 | Декстрановая матрица с обработанной поверхностью |
| Стекло с покрытием | 90–150 | 1.05 | Стекло |
Преимущества перед традиционной клеточной культурой
[ редактировать ]Возможность расширения
[ редактировать ]Заметным преимуществом использования суспензий микроносителей для культивирования клеток по сравнению с традиционными двумерными планшетами является их способность удерживать больше клеток в меньших объемах. [1] [6] Отличительной чертой обычного лабораторного протокола культивирования клеток является непрерывное пассирование , поскольку клетки довольно быстро достигают слияния на чашках, что является узким местом в производстве биологических препаратов. [1] Многослойные сосуды, сложенные друг на друга пластины, полые волокна и реакторы с насадочным слоем были другими технологиями, разработанными для борьбы с этим ограничением производительности в пластинчатой культуре клеток. [1] . [2] Хотя это было улучшением, количество клеток, полученных с помощью этих методов, все еще не достигло порога для клинического применения. [2] Однако культура клеток на микроносителях стала прорывом, необходимым для того, чтобы культура клеток достигла промышленного и клинического значения. [2] Исследования показали, что суспензии микроносителей по сравнению с культурой многослойных сосудов улучшают выход клеток в 80 раз, занимая всего десять процентов площади, соответствующей требованиям надлежащей производственной практики , и всего шестьдесят процентов от первоначальной стоимости. [4] Без необходимости постоянного пассажа снижается риск бактериального заражения, а также сводятся к минимуму затраты на рабочую силу. [2]
Однородность
[ редактировать ]Двумерная культура также страдает от плохой диффузии питательных веществ и газов, что требует равномерного распределения вручную дополнительных сред и добавок, что может привести к получению невоспроизводимых данных. [1] [2] Суспензии клеток-микроносителей в биореакторах с мешалкой обеспечивают равномерное распределение за счет гомогенного перемешивания. [1] Такие параметры, как pH, давление кислорода и концентрации добавок к среде, можно постоянно контролировать внутри биореактора, а не тестировать вручную небольшие образцы из чашек. [2] Однако высокие скорости перемешивания могут вызвать разрушительные столкновения между частицами и реактором, а слишком низкая скорость может препятствовать росту клеток, вызывая скопление частиц в «мертвой зоне» и препятствуя равномерному распределению необходимых питательных веществ. [1] [4] Поэтому необходимо рассчитать минимальный и максимальный градиенты скорости, чтобы сохранить однородность подвески, но при этом защитить ее от ненужных сил. [2] [6] Часто наиболее эффективным механизмом для этого является осевая мешалка внутри биореактора, которая позволяет эффективно перемешивать при минимальных скоростях перемешивания. [4] Гомогенная природа хорошо функционирующих биореакторов также позволяет проводить простые процедуры отбора проб и мониторинга по сравнению с двумерной культурой, которая часто страдает от утомительных процедур отбора проб. [4] [2] [6]
Физиологическая микросреда
[ редактировать ]Кроме того, трехмерная суспензионная среда высокой плотности способствует естественной морфологии и дифференцировке клеток посредством механической стимуляции. [1] С другой стороны, двумерная культура на чашках имеет тенденцию к дедифференцировке клеток в течение нескольких пассажей, поэтому общее количество пассажей должно быть ограничено. [1]
Промышленный перевод
[ редактировать ]Суспензии микроносителей также легко масштабировать за счет более высоких концентраций микрочастиц в более крупных реакторах с мешалкой, в то время как лабораторное пространство, используемое для культивирования, может быть сведено к минимуму. [2] Однако расширение платформы микроносителей также влечет за собой определенные проблемы в последующем производственном процессе. [4] Это включает в себя переработку процессов отделения и изоляции клеток. [4] Большие объемы суспензионной жидкости необходимо удалять из больших чанов биореакторов, и, следовательно, необходимо приобретать больше оборудования для обработки десятков и сотен литров раствора вместо стандартного миллилитра. [4]
Биосовместимость
[ редактировать ]Микроносители исследуются для доставки клеток для целевой тканевой инженерии. [3] Гепатоциты, хондроциты, фибробласты и другие вещества были успешно доставлены с использованием биосовместимых микроносителей к мишеням in vivo для восстановления поврежденных тканей. [1] Микроносители также можно использовать для доставки небольших молекул и белков с той же целью. [5]
Приложение
[ редактировать ]Метод сборки на основе жидкости был разработан П. Ченом и др. для сборки клеточных микроносителей в разнообразные структуры. Микроносители, засеянные нейронами, были собраны для формирования трехмерных нейронных сетей с контролируемой глобальной формой. Этот метод потенциально полезен для тканевой инженерии и нейробиологии . [7]
Внешние ссылки
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час я дж к л м Петри Ф, Зальциг Д (2021). «Влияние геометрии биореактора на производство мезенхимальных стволовых клеток в биореакторах с перемешиванием» . Химия Инжениор Техник . 93 (10): 1537–1554. doi : 10.1002/cite.202100041 . ISSN 1522-2640 . S2CID 238704820 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час я дж к л Чен АК, Реувени С, О СК (ноябрь 2013 г.). «Применение культур-микроносителей мезенхимальных и плюрипотентных стволовых клеток человека в клеточной терапии: достижения и перспективы» . Достижения биотехнологии . Инженерия стволовых клеток. 31 (7): 1032–1046. doi : 10.1016/j.biotechadv.2013.03.006 . ПМИД 23531528 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час я дж к л м н Ли Б, Ван Х, Ван Ю, Гоу В, Юань Х, Пэн Дж и др. (апрель 2015 г.). «Прошлое, настоящее и будущее тканевой инженерии на основе микроносителей» . Журнал ортопедического перевода . 3 (2): 51–57. дои : 10.1016/j.jot.2015.02.003 . ПМЦ 5982391 . ПМИД 30035040 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и ж г час я дж к л м Цай AC, Пачак CA (июль 2021 г.). «Биообработка мезенхимальных стволовых клеток человека: от планарной культуры к биореакторам на основе микроносителей» . Биоинженерия . 8 (7): 96. doi : 10.3390/bioengineering8070096 . ПМК 8301102 . ПМИД 34356203 .
- ^ Перейти обратно: а б с Баденес С.М., Фернандес Т.Г., Родригес К.А., Диого М.М., Кабрал Ж.М. (сентябрь 2016 г.). «Платформы на основе микроносителей для размножения и дифференцировки in vitro плюрипотентных стволовых клеток человека в биореакторных культуральных системах». Журнал биотехнологии . 234 : 71–82. doi : 10.1016/j.jbiotec.2016.07.023 . ПМИД 27480342 .
- ^ Перейти обратно: а б с Рафик QA, Купман К., Нинов А.В., Хьюитт CJ (март 2016 г.). «Систематический скрининг микроносителей и перемешивание условий культивирования улучшают выход мезенхимальных стволовых клеток человека в биореакторах» . Биотехнологический журнал . 11 (4): 473–486. дои : 10.1002/biot.201400862 . ПМЦ 4991290 . ПМИД 26632496 .
- ^ Чен П., Луо З., Гювен С., Тасоглу С., Ганесан А.В., Венг А., Демирчи У (сентябрь 2014 г.). «Микромасштабная сборка, управляемая шаблоном на жидкой основе» . Продвинутые материалы . 26 (34): 5936–41. дои : 10.1002/adma.201402079 . ПМК 4159433 . ПМИД 24956442 .