Колониеобразующая единица
В микробиологии . колониеобразующая единица ( КОЕ, КОЕ или КОЕ ) — это единица, которая оценивает количество микробных клеток ( бактерий , грибов , вирусов и т. д.) в образце, которые являются жизнеспособными , способными размножаться путем бинарного деления в контролируемых условиях . Подсчет с помощью колониеобразующих единиц требует культивирования микробов и подсчета только жизнеспособных клеток, в отличие от микроскопического исследования, при котором подсчитываются все клетки, живые или мертвые. Визуальный вид колонии в культуре клеток требует значительного роста, и при подсчете колоний неясно, возникла ли колония из одной клетки или группы клеток. Выражение результатов в виде колониеобразующих единиц отражает эту неопределенность.
Теория
[ редактировать ]
Целью чашечного подсчета является оценка количества присутствующих клеток на основе их способности образовывать колонии при определенных условиях питательной среды, температуры и времени. Теоретически одна жизнеспособная клетка может дать начало колонии путем репликации. Однако одиночные клетки в природе являются исключением, и, скорее всего, прародителем колонии была масса клеток, отложившихся вместе. [1] [2] Кроме того, многие бактерии растут цепочками (например, стрептококк ) или скоплениями (например, стафилококк ). По этим причинам оценка количества микробов по КОЕ в большинстве случаев не учитывает количество живых клеток, присутствующих в образце. Это связано с тем, что подсчет КОЕ предполагает, что каждая колония является отдельной и основана единственной жизнеспособной микробной клеткой. [3]
Подсчет чашек является линейным для E. coli в диапазоне от 30 до 300 КОЕ на чашке Петри стандартного размера . [4] Следовательно, чтобы гарантировать, что образец будет давать КОЕ в этом диапазоне, необходимо разбавить образец и высеять несколько разведений. Обычно используют десятикратные разведения, и серию разведений наносят в повторах по 2 или 3 в выбранном диапазоне разведений. Часто высевают 100 мкл, но используются и большие объемы, до 1 мл. Более высокие объемы покрытия увеличивают время сушки, но часто не приводят к повышению точности, поскольку могут потребоваться дополнительные этапы разбавления. [5] КОЕ/планшет считывается с планшета в линейном диапазоне, а затем КОЕ/г (или КОЕ/мл) оригинала рассчитывается математически с учетом высеянного количества и коэффициента его разведения.
Преимущество этого метода состоит в том, что разные виды микробов могут образовывать колонии, явно отличающиеся друг от друга как микроскопически , так и макроскопически . Морфология колоний может оказаться очень полезной для идентификации присутствующего микроорганизма. [6]
Предварительное понимание микроскопической анатомии организма может дать лучшее понимание того, как наблюдаемое КОЕ/мл связано с количеством жизнеспособных клеток на миллилитр. В качестве альтернативы в некоторых случаях можно уменьшить среднее количество клеток на КОЕ, встряхивая образец перед проведением разведения. Однако многие микроорганизмы являются деликатными, и при помещении их в вихрь снижается доля жизнеспособных клеток. [7]
Обозначение журнала
[ редактировать ]Концентрации колониеобразующих единиц можно выразить с использованием логарифмической записи, где указанное значение представляет собой десятичный логарифм концентрации. [8] [9] [10] Это позволяет логарифм уменьшения процесса дезактивации рассчитать как простое вычитание.
Использование
[ редактировать ]Колониеобразующие единицы используются для количественной оценки результатов во многих микробиологических методах посева и подсчета, в том числе:
- Метод разливной пластины, при котором образец суспендируют в чашке Петри с использованием расплавленного агара, охлажденного примерно до 40–45 ° C (чуть выше точки затвердевания, чтобы минимизировать гибель клеток, вызванную нагреванием). После затвердевания питательного агара чашку инкубируют. [11]
- Метод расправленной чашки, при котором образец (в небольшом объеме) распределяют по поверхности чашки с питательным агаром и дают высохнуть перед инкубацией для подсчета. [11]
- Метод мембранной фильтрации, при котором образец фильтруется через мембранный фильтр, затем фильтр помещается на поверхность пластинки с питательным агаром (бактериями вверх). Во время инкубации питательные вещества просачиваются через фильтр, поддерживая растущие клетки. Поскольку площадь поверхности большинства фильтров меньше, чем у стандартной чашки Петри, линейный диапазон количества чашек будет меньше. [11]
- Методы Майлза и Мисры или метод капельной чашки, при котором очень небольшую аликвоту (обычно около 10 микролитров) образца из каждого серийного разведения наносят на чашку Петри. Капельную чашку необходимо читать, пока колонии очень малы, чтобы предотвратить потерю КОЕ по мере их совместного роста. [12]
Однако при методах, требующих использования агаровой пластинки, нельзя использовать жидкий раствор, поскольку невозможно определить чистоту образца и невозможно подсчитать клетки в жидкости по одной. [13]
Инструменты для подсчета колоний
[ редактировать ]
Подсчет колоний традиционно проводится вручную с помощью ручки и счетчика кликов. Обычно это простая задача, но она может оказаться очень трудоемкой и отнимать много времени, если необходимо пронумеровать множество пластин. В качестве альтернативы можно использовать полуавтоматические (программные) и автоматические (аппаратное + программное обеспечение) решения. [14] [15] [16]
Программное обеспечение для подсчета КОЕ
[ редактировать ]Колонии можно подсчитать по изображениям чашек с помощью программных средств. Экспериментаторы обычно фотографировали каждую пластинку, которую им нужно было пересчитать, а затем анализировали все снимки (это можно сделать с помощью простой цифровой камеры или даже веб-камеры). Поскольку для получения одного изображения требуется менее 10 секунд, а не несколько минут для ручного подсчета КОЕ, этот подход обычно экономит много времени. Кроме того, он более объективен и позволяет извлекать другие переменные, такие как размер и цвет колоний. [16]
- OpenCFU — это бесплатная программа с открытым исходным кодом, предназначенная для оптимизации удобства использования, скорости и надежности. Он предлагает широкий спектр фильтров и элементов управления, а также современный пользовательский интерфейс. OpenCFU написан на C++ и использует OpenCV для анализа изображений. [17]
- NICE — это программа, написанная на MATLAB , которая обеспечивает простой способ подсчета колоний на изображениях. [18]
- ImageJ и CellProfiler : некоторые макросы ImageJ [19] плагины и некоторые конвейеры CellProfiler. [20] можно использовать для подсчета колоний. Это часто требует от пользователя изменения кода для достижения эффективного рабочего процесса, но может оказаться полезным и гибким. Одной из основных проблем является отсутствие специального графического интерфейса , который может сделать взаимодействие с алгоритмами обработки утомительным.
Помимо программного обеспечения для традиционных настольных компьютеров, доступны приложения для устройств Android и iOS для полуавтоматического и автоматического подсчета колоний. Встроенная камера используется для фотографирования чашки с агаром, а для обработки данных изображения и оценки количества колоний используется внутренний или внешний алгоритм. [21] [22] [23]
Автоматизированные системы
[ редактировать ]Многие автоматизированные системы используются для противодействия человеческим ошибкам , поскольку многие методы исследования, выполняемые людьми, подсчитывающие отдельные клетки, имеют высокую вероятность ошибки. В связи с тем, что исследователи регулярно подсчитывают клетки вручную с помощью проходящего света, этот метод, подверженный ошибкам, может оказать существенное влияние на расчетную концентрацию в основной жидкой среде, когда количество клеток небольшое. [24]
Полностью автоматизированные системы также доступны у некоторых производителей биотехнологий. [25] [26] Они, как правило, дороги и не так гибки, как отдельное программное обеспечение, поскольку аппаратное и программное обеспечение предназначены для совместной работы в конкретной конфигурации. [18] Альтернативно, некоторые автоматические системы используют принцип спирального покрытия . [27]
Некоторые автоматизированные системы, такие как системы MATLAB, позволяют подсчитывать клетки без необходимости их окрашивания. Это позволяет повторно использовать колонии для других экспериментов без риска убить микроорганизмы пятнами. Однако недостатком этих автоматизированных систем является то, что чрезвычайно трудно отличить микроорганизмы по пыли или царапинам на чашках с кровяным агаром, поскольку и пыль, и царапины могут создавать весьма разнообразные комбинации форм и внешнего вида. [28]
Альтернативные единицы
[ редактировать ]Вместо колониеобразующих единиц используются параметры « Наиболее вероятное число» (MPN) и «Модифицированные фишманские единицы» (MFU). [29] можно использовать. Метод наиболее вероятного числа подсчитывает жизнеспособные клетки и полезен при подсчете низких концентраций клеток или подсчете микробов в продуктах, где наличие твердых частиц делает подсчет на чашках непрактичным. [30] Модифицированные блоки Fishman учитывают бактерии, которые являются жизнеспособными, но некультивируемыми.
См. также
[ редактировать ]- Подсчет клеток
- Среда роста
- Метод Майлза и Мисры
- Наиболее вероятное число
- Реплика покрытия
- Вирусный налет
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Аманн, Род-Айленд; Людвиг, В; Шлейфер, К.Х. (1995). «Филогенетическая идентификация и обнаружение in situ отдельных микробных клеток без культивирования» . Микробиологические обзоры . 59 (1): 143–169. дои : 10.1128/мр.59.1.143-169.1995 . ISSN 0146-0749 . ПМК 239358 . PMID 7535888 .
- ^ Стейли, Джеймс Т.; Конопка, Аллан (1985). «Измерение активности нефотосинтетических микроорганизмов in situ в водных и наземных средах обитания» . Ежегодный обзор микробиологии . 39 (1): 321–346. дои : 10.1146/annurev.mi.39.100185.001541 . ISSN 0066-4227 . ПМИД 3904603 .
- ^ Гольдман, Эмануэль; Грин, Лорренс Х. (24 августа 2008 г.). Практическое руководство по микробиологии, второе издание (электронная книга Google) (второе изд.). США: CRC Press, Taylor and Francisco Group. п. 864. ИСБН 978-0-8493-9365-5 . Проверено 16 октября 2014 г.
- ^ Порода, РС; Доттеррер, В.Д. (май 1916 г.). «Допустимое количество колоний на чашках с удовлетворительным агаром» . Журнал бактериологии . 1 (3): 321–31. дои : 10.1128/JB.1.3.321-331.1916 . ПМЦ 378655 . ПМИД 16558698 .
- ^ Шуг, Анджела Р.; Бартель, Александр; Мёрер, Марита; Шольцек, Анисса Д.; Бромбах, Джулиан; Хензель, Вивиан; Фаннинг, Симус; Шварц, Стефан; Фесслер, Андреа Т. (1 декабря 2020 г.). «Сравнение двух методов определения количества клеток при определении чувствительности к биоцидам» . Ветеринарная микробиология . 251 : 108831. doi : 10.1016/j.vetmic.2020.108831 . ПМИД 33202368 . S2CID 225308316 .
- ^ Бадиян, Саидесадат; Дилмагани-Маранд, Арезу; Хаджипур, Мохаммад Джавад; Амери, Али; Раззаги, Мохаммад Реза; Рафи-Табар, Хашем; Махмуди, Мортеза; Сасанпур, Пежман (17 июля 2018 г.). «Обнаружение и дискриминация бактериальных колоний с помощью матричной визуализации Мюллера» . Научные отчеты 8 (1):10815.doi : 10.1038 /s41598-018-29059-5 . ISSN 2045-2322 . ПМК 6050273 . ПМИД 30018335 .
- ^ Фоладори, Паола; Лаура, Бруни; Джанни, Андреоттола; Джулиано, Зильо (2007). «Влияние обработки ультразвуком на жизнеспособность бактерий на очистных сооружениях, оцененное с помощью проточной цитометрии - индикаторы фекалий, сточные воды и активный ил» . Исследования воды . 41 (1): 235–243. дои : 10.1016/j.watres.2006.08.021 . ПМИД 17052743 .
- ^ «Log10 колониеобразующих единиц на грамм» . Энциклопедия Тити Тудоранча . Проверено 25 сентября 2016 г.
- ^ Фунг, Дэниел Ю.К. (2009). «Количество жизнеспособных клеток» . Бионаука Интернэшнл . Проверено 25 сентября 2016 г.
- ^ Коул, Мартин (1 ноября 2005 г.). «Принципы микробиологического тестирования: Статистическая основа отбора проб» (PDF) . Международная комиссия по микробиологическим спецификациям пищевых продуктов (ICMSF). Архивировано из оригинала (PDF) 31 октября 2017 года . Проверено 25 сентября 2016 г.
- ^ Jump up to: а б с «USP 61: Тесты для подсчета микроорганизмов» . Фармакопея США . Проверено 21 мая 2024 г.
- ^ Уитмир, Жаннетт М.; Меррелл, Д. Скотт (2012), Хоутон, Жан-Мари (редактор), «Успешные методы культивирования видов Helicobacter: общие методы культивирования Helicobacter pylori» , Виды Helicobacter , Методы молекулярной биологии, том. 921, Тотова, Нью-Джерси: Humana Press, стр. 17–27, doi : 10.1007/978-1-62703-005-2_4 , ISBN 978-1-62703-004-5 , PMID 23015487 , получено 1 декабря 2023 г.
- ^ Рейнольдс, Джеки. «Протоколы серийного разведения» . www.microbelibrary.org . Архивировано из оригинала 17 ноября 2015 года . Проверено 15 ноября 2015 г.
- ^ Брюггер, Сильвио Д.; Баумбергер, Кристиан; Йост, Марсель; Дженни, Вернер; Брюггер, Урс; Мюлеманн, Катрин (20 марта 2012 г.). Бересвилл, Стефан (ред.). «Автоматизированный подсчет бактериальных колониеобразующих единиц на чашках с агаром» . ПЛОС ОДИН . 7 (3): e33695. Бибкод : 2012PLoSO...733695B . дои : 10.1371/journal.pone.0033695 . ISSN 1932-6203 . ПМК 3308999 . ПМИД 22448267 .
- ^ Хан, Ариф уль Маула; Торелли, Анджело; Вольф, Иво; Гретц, Норберт (8 мая 2018 г.). «AutoCellSeg: надежный автоматический блок формирования колоний (КОЕ)/анализ клеток с использованием адаптивной сегментации изображений и простых в использовании методов постредактирования» . Научные отчеты . 8 (1): 7302. doi : 10.1038/s41598-018-24916-9 . ISSN 2045-2322 . ПМК 5940850 . ПМИД 29739959 .
- ^ Jump up to: а б Чжан, Луи (5 ноября 2022 г.). «Машинное обучение для подсчета клеточных колониеобразующих единиц» . Визуальные вычисления для промышленности, биомедицины и искусства . 5 (1): 26. дои : 10.1186/s42492-022-00122-3 . ISSN 2524-4442 . ПМЦ 9637067 . ПМИД 36334176 .
- ^ Гейссманн, Квентин (2013). «OpenCFU, новое бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом для подсчета колоний клеток и других круглых объектов» . ПЛОС ОДИН . 8 (2): e54072. arXiv : 1210.5502 . Бибкод : 2013PLoSO...854072G . дои : 10.1371/journal.pone.0054072 . ПМЦ 3574151 . ПМИД 23457446 .
- ^ Jump up to: а б Кларк, Мэтью Л.; Бертон, Роберт Л.; Хилл, А. Найо; Литория, Маритони; Нам, Мун Х.; Хван, Джисон (август 2010 г.). «Недорогой, высокопроизводительный, автоматизированный подсчет бактериальных колоний» . Цитометрия Часть А. 77 (8): 790–797. doi : 10.1002/cyto.a.20864 . ПМЦ 2909336 . ПМИД 20140968 .
- ^ Цай, Чжунли; Чаттопадхьяй, Ниладри; Лю, Вэньчао Джессика; Чан, Конрад; Пиньоль, Жан-Филипп; Рейли, Раймонд М. (ноябрь 2011 г.). «Оптимизированный цифровой подсчет колоний в клоногенных анализах с использованием программного обеспечения ImageJ и индивидуальных макросов: сравнение с ручным подсчетом». Международный журнал радиационной биологии . 87 (11): 1135–1146. дои : 10.3109/09553002.2011.622033 . ПМИД 21913819 . S2CID 25417288 .
- ^ Брей, Марк-Энтони; Воукс, Марта С.; Карпентер, Энн Э. (январь 2015 г.). «Использование CellProfiler для автоматической идентификации и измерения биологических объектов на изображениях» . Современные протоколы молекулярной биологии . 109 (1): 14.17.1–14.17.13. дои : 10.1002/0471142727.mb1417s109 . ПМК 4302752 . ПМИД 25559103 .
- ^ Ардуэнго, Микеле (29 марта 2013 г.). «Теперь доступно для покупки: приложение Promega Colony Counter» . Соединения Промеги .
- ^ Мука, Майкл; Мюгг, Вероника; Шлоттербек, Анн-Катрин; Штегер, Лоран; Генш, Александр; Хеллер, Стефани; Эгли, Адриан (август 2022 г.). «Работа четырех приложений для подсчета бактериальных клеток на смартфонах» . Журнал микробиологических методов . 199 : 106508. doi : 10.1016/j.mimet.2022.106508 . ПМИД 35691441 .
- ^ Аустержост, Йонас; Марквард, Дэниел; Раддац, Лукас; Гейер, Доминик; Беккер, Томас; Шепер, Томас; Линднер, Патрик; Бойтель, Саша (август 2017 г.). «Приложение для интеллектуальных устройств для автоматического определения колоний E. coli на чашках с агаром» . Инженерное дело в науках о жизни . 17 (8): 959–966. дои : 10.1002/elsc.201700056 . ISSN 1618-0240 . ПМК 6999497 . ПМИД 32624845 .
- ^ Джарвис, Бэзил (2016). «Ошибки, связанные с процедурами подсчета колоний». Статистические аспекты микробиологического исследования пищевых продуктов . Эльзевир: 119–140. дои : 10.1016/b978-0-12-803973-1.00007-3 . ISBN 978-0-12-803973-1 .
- ^ Хойзер, Элиза; Беккер, Карстен; Иделевич Евгений А. (17 августа 2023 г.). «Оценка автоматизированной системы подсчета микробных колоний» . Микробиологический спектр . 11 (4): e00673-23. дои : 10.1128/spectrum.00673-23 . ПМЦ 10433998 . ПМИД 37395656 .
- ^ «Видео «Полностью автоматический счетчик колоний с помощью лабораторного оборудования AAA» . ЛабТьюб . 7 августа 2015 г. Проверено 28 сентября 2018 г.
- ^ Гилкрист, Дж. Э.; Кэмпбелл, Дж. Э.; Доннелли, CB; Пилер, Дж. Т.; Делани, Дж. М. (1973). «Метод определения бактерий на спиральных пластинах» . Прикладная микробиология . 25 (2): 244–252. дои : 10.1128/25.2.244-252.1973 . ISSN 0003-6919 . ПМК 380780 . ПМИД 4632851 .
- ^ Брюггер, Сильвио Д.; Баумбергер, Кристиан; Йост, Марсель; Дженни, Вернер; Брюггер, Урс; Мюлеманн, Катрин (20 марта 2012 г.). «Автоматизированный подсчет бактериальных колониеобразующих единиц на чашках с агаром» . ПЛОС ОДИН . 7 (3): e33695. Бибкод : 2012PLoSO...733695B . дои : 10.1371/journal.pone.0033695 . ISSN 1932-6203 . ПМК 3308999 . ПМИД 22448267 .
- ^ Дехорити, бакалавр наук; Тирабассо, Пенсильвания; Грифо, АП (1989). «Процедуры определения наиболее вероятного количества бактерий рубца, включая одновременную оценку общего и целлюлолитического количества в одной среде» . Прикладная и экологическая микробиология . 55 (11): 2789–2792. дои : 10.1128/aem.55.11.2789-2792.1989 . ISSN 0099-2240 . ПМК 203169 . ПМИД 2624460 .
- ^ Блоджетт, Роберт (октябрь 2010 г.). «Бактериальное аналитическое руководство: наиболее вероятное число по серийным разведениям» . США Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Фишман, Уильям Х.; Бернфельд, Питер (1955). [31] Глюкуронидазы . Методы энзимологии. Том. 1. С. 262–9 . дои : 10.1016/0076-6879(55)01035-5 . ISBN 978-0-12-181801-2 .