Флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ

Иммуноанализ флуоресцентной поляризации ( FPIA ) — это класс биохимических тестов in vitro, используемых для быстрого обнаружения антител или антигенов в образце. FPIA — это конкурентный гомогенный анализ , который состоит из простого метода приготовления и считывания без необходимости этапов разделения или промывки.

В основе анализа лежит анизотропия флуоресценции , также известная как поляризация флуоресценции. Если флуоресцентная молекула неподвижна и подвергается воздействию плоскополяризованного света , она возбуждается и , следовательно, излучает излучение обратно в поляризованную плоскость. Однако если возбужденная флуоресцентная молекула находится в движении (вращательном или поступательном) в течение срока жизни флуоресценции, она будет излучать свет в направлении, отличном от плоскости возбуждения. Время жизни флуоресценции представляет собой промежуток времени между моментом поглощения и моментом флуоресцентного излучения.

Обычно скорость вращения молекулы указывает на ее размер. ^{[ 1 ]} Когда молекула, меченная флуоресцентной меткой (трейсер), связывается с другой молекулой, вращательное движение изменится, что приведет к изменению интенсивности плоскополяризованного света, что приведет к изменению поляризации флуоресценции. ^{[ 2 ]} В иммуноанализах флуоресцентной поляризации используется флуорофором связанный с антиген , который при связывании с интересующим антителом увеличивает поляризацию флуоресценции. Изменение поляризации пропорционально количеству антигена в образце и измеряется флуоресцентным анализатором поляризации. ^{[ 3 ]}

История

Поляризацию флуоресценции впервые наблюдал Ф. Вейгерт в 1920. Он экспериментировал с растворами флуоресцеина, эозина и других красителей при различных температурах и вязкостях. Наблюдая, что поляризация увеличивается с вязкостью растворителя и размером молекулы красителя, но уменьшается с увеличением температуры, он пришел к выводу, что поляризация увеличивается с уменьшением подвижности излучающих частиц. ^{[ 2 ]} С 1925 по 1926 год Фрэнсис Перрен подробно изложил количественную теорию поляризации флуоресценции во многих значительных публикациях, которые остаются актуальными и по сей день. ^{[ 2 ]}

Со времени вклада Перрина этот метод вырос от определения изотерм связывания при строго контролируемых параметрах до изучения взаимодействий связывания антиген - антитело , малая молекула - белок и гормон - рецептор . ^{[ 4 ]} Иммуноанализ флуоресцентной поляризации был впервые описан и использован в 1960-х годах. ^{[ 5 ]}^{[ 6 ]} Конкурентная гомогенная характеристика позволила автоматизировать флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ намного проще, чем другие методы иммуноанализа, такие как радиоиммуноанализы или иммуноферментные анализы . ^{[ 4 ]}

Несмотря на то, что этот метод зародился как метод исследования прямого взаимодействия, с середины 1990-х годов этот метод был принят на вооружение высокопроизводительным скринингом (HTS), чтобы облегчить процесс открытия лекарств путем изучения сложных ферментативных взаимодействий . ^{[ 4 ]}

Принцип

FPIA количественно определяет изменение поляризации флуоресценции реакционных смесей флуоресцентно-меченного индикатора, образца антигена и определяемого антитела . Работа при фиксированной температуре и вязкости позволяет сделать поляризацию флуоресценции прямо пропорциональной размеру флуорофора. Свободный индикатор в растворе имеет более низкую поляризацию флуоресценции, чем связанный с антителом индикатор с более медленным броуновским движением . Индикатор и специфический антиген будут конкурировать за связывание с антителом, и если концентрация антигена низкая, большее количество индикатора будет связано с антителом, что приведет к более высокой поляризации флуоресценции, и наоборот. ^{[ 7 ]}

Обычное FPIA следует следующей процедуре:

Определенное количество образца добавляется в реакционный буфер.
Раствору дают достичь равновесия при комнатной температуре в течение примерно двух минут.
Решение оценивается в анализаторе поляризации флуоресценции для получения базовых измерений.
К раствору добавляют определенное количество антигена, конъюгированного с флуорофором.
Раствор снова уравновешивается примерно в течение двух минут.
Решение снова оценивается с помощью анализатора поляризации флуоресценции.
Значение поляризации флуоресценции раствора, содержащего индикатор, сравнивается с базовой линией, и величина разницы пропорциональна количеству целевого аналита в образце. ^{[ 1 ]}

Приложения

FPIA стал жизнеспособным методом количественного определения малых молекул в смесях, в том числе: пестицидах , ^{[ 8 ]} микотоксины ^{[ 9 ]} в продуктах питания, фармацевтических соединениях в сточных водах, ^{[ 10 ]} метаболиты в моче и сыворотке крови, указывающие на употребление наркотиков ( каннабиноиды , амфетамины , барбитураты , кокаин , бензодиазепины , метадон , опиаты и PCP ), ^{[ 11 ]}^{[ 12 ]} и различные низкомолекулярные токсины . А также при анализе гормон - рецепторных взаимодействий. ^{[ 4 ]}

См. также

Ссылки

^ Перейти обратно: ^а ^б Нильсен К., Лин М., Галл Д., Джолли М. (сентябрь 2000 г.). «Иммуноанализ флуоресцентной поляризации: обнаружение антител к Brucella abortus». Методы . 22 (1): 71–6. дои : 10.1006/meth.2000.1038 . ПМИД 11020320 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с Джеймсон Д. (2003). «Поляризация флуоресценции: прошлое, настоящее и будущее». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 6 (3): 167–176. дои : 10.2174/138620703106298347 . PMID 12678695 – через ResearchGate.
^ Попелка С (1981). «Иммунологический анализ флуоресценции II. Анализатор для быстрого и точного измерения поляризации флуоресценции с использованием одноразовых кювет» . Клин Чем . 27 (7): 1198–1201. дои : 10.1093/клинчем/27.7.1198 . ПМИД 7016373 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Леа В.А., Симеонов А (январь 2011 г.). «Анализ поляризации флуоресценции при скрининге малых молекул» . Мнение экспертов об открытии лекарств . 6 (1): 17–32. дои : 10.1517/17460441.2011.537322 . ПМЦ 3277431 . ПМИД 22328899 .
^ Ватанабэ Ф (1988). Теория и применение флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа . Нью-Йорк: Пленум Пресс. стр. 199–200.
^ Насир М (1999). «Поляризация флуоресценции: аналитический инструмент для иммуноанализа и открытия лекарств». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 2 (4): 177–190. дои : 10.2174/1386207302666220204192916 . ПМИД 10469879 . S2CID 20003324 – через ResearchGate.
^ Смит Д.С., Еремин С.А. (июль 2008 г.). «Иммуноанализы с флуоресцентной поляризацией и родственные методы для простого и высокопроизводительного скрининга малых молекул». Аналитическая и биоаналитическая химия . 391 (5): 1499–507. дои : 10.1007/s00216-008-1897-z . ПМИД 18264817 . S2CID 24167641 .
^ Еремин С.А., Смит Д.С. (май 2003 г.). «Иммуноанализ флуоресцентной поляризации пестицидов». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 6 (3): 257–66. дои : 10.2174/138620703106298301 . ПМИД 12678704 .
^ Марагос С (декабрь 2009 г.). «Флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ микотоксинов: обзор» . Токсины . 1 (2): 196–207. дои : 10.3390/toxins1020196 . ПМК 3202780 . ПМИД 22069541 .
^ Оберлейтнер Л., Дамен-Левисон У., Гарбе Л.А., Шнайдер Р.Дж. (май 2017 г.). «Применение флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа для определения карбамазепина в сточных водах». Журнал экологического менеджмента . 193 : 92–97. дои : 10.1016/j.jenvman.2017.01.063 . ПМИД 28192740 .
^ Рэми К.Л., Ковач С.Дж., Мартин Д.Е., Йоркаски Д.К. (май 1998 г.). «Результаты скрининга мочи на наркотики у добровольцев в фазе I клинических фармакологических исследований: нас вводят в заблуждение?». Журнал клинической фармакологии . 38 (5): 413–6. дои : 10.1002/j.1552-4604.1998.tb04445.x . ПМИД 9602952 . S2CID 21496845 .
^ Эдмондс Д. (12 декабря 2000 г.). «Метод диагностики флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа US 6159750A» . Гугл Патенты . Проверено 6 апреля 2017 г.

[:1-1] Перейти обратно: ^а ^б Нильсен К., Лин М., Галл Д., Джолли М. (сентябрь 2000 г.). «Иммуноанализ флуоресцентной поляризации: обнаружение антител к Brucella abortus». Методы . 22 (1): 71–6. дои : 10.1006/meth.2000.1038 . ПМИД 11020320 .

[:0-2] Перейти обратно: ^а ^б ^с Джеймсон Д. (2003). «Поляризация флуоресценции: прошлое, настоящее и будущее». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 6 (3): 167–176. дои : 10.2174/138620703106298347 . PMID 12678695 – через ResearchGate.

[3] Попелка С (1981). «Иммунологический анализ флуоресценции II. Анализатор для быстрого и точного измерения поляризации флуоресценции с использованием одноразовых кювет» . Клин Чем . 27 (7): 1198–1201. дои : 10.1093/клинчем/27.7.1198 . ПМИД 7016373 .

[:2-4] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д Леа В.А., Симеонов А (январь 2011 г.). «Анализ поляризации флуоресценции при скрининге малых молекул» . Мнение экспертов об открытии лекарств . 6 (1): 17–32. дои : 10.1517/17460441.2011.537322 . ПМЦ 3277431 . ПМИД 22328899 .

[5] Ватанабэ Ф (1988). Теория и применение флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа . Нью-Йорк: Пленум Пресс. стр. 199–200.

[6] Насир М (1999). «Поляризация флуоресценции: аналитический инструмент для иммуноанализа и открытия лекарств». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 2 (4): 177–190. дои : 10.2174/1386207302666220204192916 . ПМИД 10469879 . S2CID 20003324 – через ResearchGate.

[7] Смит Д.С., Еремин С.А. (июль 2008 г.). «Иммуноанализы с флуоресцентной поляризацией и родственные методы для простого и высокопроизводительного скрининга малых молекул». Аналитическая и биоаналитическая химия . 391 (5): 1499–507. дои : 10.1007/s00216-008-1897-z . ПМИД 18264817 . S2CID 24167641 .

[8] Еремин С.А., Смит Д.С. (май 2003 г.). «Иммуноанализ флуоресцентной поляризации пестицидов». Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг . 6 (3): 257–66. дои : 10.2174/138620703106298301 . ПМИД 12678704 .

[9] Марагос С (декабрь 2009 г.). «Флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ микотоксинов: обзор» . Токсины . 1 (2): 196–207. дои : 10.3390/toxins1020196 . ПМК 3202780 . ПМИД 22069541 .

[10] Оберлейтнер Л., Дамен-Левисон У., Гарбе Л.А., Шнайдер Р.Дж. (май 2017 г.). «Применение флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа для определения карбамазепина в сточных водах». Журнал экологического менеджмента . 193 : 92–97. дои : 10.1016/j.jenvman.2017.01.063 . ПМИД 28192740 .

[11] Рэми К.Л., Ковач С.Дж., Мартин Д.Е., Йоркаски Д.К. (май 1998 г.). «Результаты скрининга мочи на наркотики у добровольцев в фазе I клинических фармакологических исследований: нас вводят в заблуждение?». Журнал клинической фармакологии . 38 (5): 413–6. дои : 10.1002/j.1552-4604.1998.tb04445.x . ПМИД 9602952 . S2CID 21496845 .

[12] Эдмондс Д. (12 декабря 2000 г.). «Метод диагностики флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа US 6159750A» . Гугл Патенты . Проверено 6 апреля 2017 г.

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]