Устройство считывания пластин

Считыватели планшетов , также известные как считыватели микропланшетов или фотометры для микропланшетов , представляют собой инструменты, которые используются для обнаружения биологических , химических или физических явлений в образцах в планшетах для микротитрования . Они широко используются в исследованиях, открытии лекарств , ^[1] валидация биоанализа, контроль качества и производственные процессы в фармацевтической и биотехнологической промышленности и академических организациях. Реакции проб можно анализировать в микротитровальных планшетах формата 1–1536 лунок. Наиболее распространенный формат микропланшетов, используемый в академических исследовательских лабораториях или клинико-диагностических лабораториях, — это 96-луночный (матрица 8 на 12) с типичным реакционным объемом от 100 до 200 мкл на лунку. Микропланшеты с более высокой плотностью (384- или 1536-луночные микропланшеты) обычно используются для скрининга, когда производительность (количество обрабатываемых образцов в день) и стоимость анализа на образец становятся критическими параметрами, при этом типичный объем анализа составляет от 5 до 50 мкл на лунку. . Обычными режимами обнаружения для микропланшетных анализов являются поглощение, флуоресценции интенсивность , люминесценция , флуоресценция с временным разрешением и поляризация флуоресценции .

Методы

Поглощение

Обнаружение поглощения доступно в устройствах для чтения микропланшетов уже более трех десятилетий и используется для таких анализов, как анализы ELISA , количественное определение белка и нуклеиновых кислот или анализы активности ферментов. ^[2] (т.е. в МТТ-анализе жизнеспособности клеток). ^[3] Источник света освещает образец с использованием определенной длины волны (выбираемой оптическим фильтром или монохроматором), а светоприемник, расположенный на другой стороне лунки, измеряет, какая часть первоначального (100%) света проходит через образец. : количество прошедшего света обычно связано с концентрацией интересующей молекулы. Некоторые традиционные колориметрические анализаторы были миниатюризированы для количественной работы в планшет-ридере с производительностью, подходящей для исследовательских целей. Примеры анализов, преобразованных в методы планшетного считывания, включают несколько анализов на аммоний , нитраты , нитриты , ^[4] мочевина , ^[5] железо(II), ^[6] и ортофосфат . ^[7] Более поздние колориметрические химические методы были разработаны непосредственно для использования в устройствах для считывания планшетов. ^[8]

флуоресценция

За последние два десятилетия обнаружение интенсивности флуоресценции получило очень широкое развитие в формате микропланшетов. Спектр применения гораздо шире, чем при использовании детектирования по поглощению, но аппаратура обычно дороже. В приборах этого типа первая оптическая система (система возбуждения) освещает образец с использованием определенной длины волны (выбираемой оптическим фильтром или монохроматором). В результате освещения образец излучает свет (он флуоресцирует), а вторая оптическая система (эмиссионная система) собирает излучаемый свет, отделяет его от возбуждающего света (с помощью фильтра или системы монохроматора) и измеряет сигнал с помощью детектор света, такой как фотоумножитель (ФЭУ). Преимуществами флуоресцентного обнаружения перед обнаружением по поглощению являются чувствительность, а также диапазон применения, учитывая широкий выбор флуоресцентных меток, доступных сегодня. Например, метод, известный как визуализация кальция, измеряет интенсивность флуоресценции чувствительные к кальцию красители для оценки внутриклеточного уровня кальция. ^[9]

Люминесценция

Люминесценция является результатом химической или биохимической реакции. Обнаружение люминесценции оптически проще, чем обнаружение флуоресценции, поскольку люминесценция не требует источника света для возбуждения или оптики для выбора дискретных длин волн возбуждения. Типичная люминесцентная оптическая система состоит из светонепроницаемой считывающей камеры и детектора ФЭУ . Некоторые считыватели пластин используют аналоговый детектор ФЭУ, в то время как другие имеют детектор ФЭУ, подсчитывающий фотоны . Счет фотонов широко признан наиболее чувствительным средством обнаружения люминесценции. Некоторые устройства для считывания пластин предлагают колесо фильтров или оптические системы монохроматора с перестраиваемой длиной волны для выбора определенных длин волн люминесценции. Возможность выбора нескольких длин волн или даже диапазонов длин волн позволяет обнаруживать анализы, которые содержат несколько люминесцентных репортерных ферментов, разрабатывать новые люминесцентные анализы, а также является средством оптимизации соотношения сигнал/шум. ^{[ нужна ссылка ]}

Общие применения включают анализы экспрессии генов на основе люциферазы , а также анализы жизнеспособности клеток, цитотоксичности и биоритмов, основанные на люминесцентном обнаружении АТФ . ^[10]

Флуоресценция с временным разрешением (TRF)

Измерение флуоресценции с временным разрешением (TRF) очень похоже на измерение интенсивности флуоресценции (FI). Единственная разница заключается во времени процесса возбуждения/измерения. При измерении ФИ процессы возбуждения и излучения происходят одновременно: свет, излучаемый образцом, измеряется в процессе возбуждения. Несмотря на то, что эмиссионные системы очень эффективны в удалении возбуждающего света до того, как он достигнет детектора, количество возбуждающего света по сравнению с эмиссионным светом таково, что измерения FI всегда демонстрируют довольно повышенные фоновые сигналы. TRF предлагает решение этой проблемы. Он основан на использовании очень специфических флуоресцентных молекул, называемых лантанидами , которые обладают необычным свойством излучать в течение длительных периодов времени (измеряемых в миллисекундах) после возбуждения, в то время как большинство стандартных флуоресцентных красителей (например, флуоресцеин) излучают в течение нескольких наносекунд после воздействия. взволнованный. В результате можно возбудить лантаноиды с помощью импульсного источника света (например, ксеноновой импульсной лампы или импульсного лазера) и проводить измерения после импульса возбуждения. Это приводит к более низкому фону измерений, чем при стандартных анализах FI. Недостатки заключаются в том, что инструменты и реагенты обычно более дорогие, а приложения должны быть совместимы с использованием этих очень специфических лантаноидных красителей. TRF в основном используется в приложениях для скрининга лекарств в форме, называемой TR-FRET (перенос энергии флуоресценции с временным разрешением). ТР- Анализы FRET очень надежны (ограниченная чувствительность к нескольким типам помех анализа) и легко миниатюризируются. Надежность, возможность автоматизации и миниатюризации — это характеристики, которые очень привлекательны для скрининговой лаборатории. ^{[ нужна ссылка ]}

Поляризация флуоресценции

Измерение поляризации флуоресценции также очень близко к обнаружению FI. Отличие состоит в том, что оптическая система включает в себя поляризационные фильтры на пути света: образцы в микропланшете возбуждаются поляризованным светом (вместо неполяризованного света в режимах FI и TRF). В зависимости от подвижности флуоресцентных молекул, обнаруженных в лунках, излучаемый свет будет либо поляризованным, либо нет. Например, большие молекулы (например, белки) в растворе, которые вращаются относительно медленно из-за своего размера, будут излучать поляризованный свет при возбуждении поляризованным светом. С другой стороны, быстрое вращение более мелких молекул приведет к деполяризации сигнала. Эмиссионная система устройства для считывания пластин использует поляризационные фильтры для анализа полярности излучаемого света. Низкий уровень поляризации указывает на то, что небольшие флуоресцентные молекулы свободно перемещаются в образце. Высокий уровень поляризации указывает на то, что флуоресцент присоединен к более крупному молекулярному комплексу. В результате одним из основных применений обнаружения FP являются анализы молекулярного связывания, поскольку они позволяют определить, связывается (или нет) небольшая флуоресцентная молекула с более крупной нефлуоресцентной молекулой: связывание приводит к более медленной скорости вращения флуоресцентной молекулы и в увеличении поляризации сигнала. ^{[ нужна ссылка ]}

Рассеяние света и нефелометрия

Рассеяние света и нефелометрия являются методами определения мутности раствора (т.е. нерастворимых частиц в растворе). Луч света проходит через образец и рассеивается взвешенными частицами. Измеренный свет, рассеянный вперед, показывает количество нерастворимых частиц, присутствующих в растворе. Общие применения нефелометрии/светорассеяния включают автоматизированный скрининг растворимости лекарственного средства HTS, долгосрочную кинетику роста микроорганизмов, флокуляцию, агрегацию и мониторинг полимеризации и осаждения, включая иммунопреципитацию. ^{[ нужна ссылка ]}

Инструменты и анализы

Многие из режимов обнаружения (поглощение, интенсивность флуоресценции, люминесценция, флуоресценция с временным разрешением и поляризация флуоресценции) доступны отдельно в специализированных устройствах для считывания планшетов, но сегодня очень часто встречаются объединенными в один прибор (многорежимное устройство для считывания планшетов). Существуют также приборы для измерения динамического или статического света, рассеянного от образцов в микропланшете. Спектр применения многорежимных планшетных считывателей чрезвычайно широк. Некоторые из наиболее распространенных анализов:

ИФА
роста белков и клеток Анализы
Белок: белковые взаимодействия
Репортерные анализы
Количественное определение нуклеиновой кислоты
Молекулярные взаимодействия
Ферментативная активность
Клеточная токсичность, пролиферация и жизнеспособность
Количественное определение АТФ
Иммуноанализы ^[11]
Высокопроизводительный скрининг соединений и мишеней при поиске лекарств (маркировка Alpha Screen на большинстве приборов) ^[12]
Анализ эпитопов на основе шариков ^[13]
Клеточное поглощение наночастиц ^[14]

Хотя «считыватель планшетов» обычно относится к устройствам, описанным выше, доступно множество вариаций. Некоторые примеры других устройств, работающих с форматом микропланшетов:

Считыватели планшетов ELISPOT , используемые для подсчета цветных пятен, образующихся в ходе анализов ELISPOT.
Высокопроизводительные сканеры, которые могут одновременно измерять все лунки микропланшета
Системы скрининга высокого содержания (HCS), которые отображают каждую лунку с высоким разрешением для изучения клеточных популяций.
Приборы без маркировки, в которых используются специализированные микропланшеты для измерения событий связывания без использования химических маркеров.

Ссылки

^ Невес, Бруно Младший; Агнес, Джонатан Пауло; Гомес, Марсело ду Насименту; Энрикес Донса, Марсио Роберто; Гонсалвес, Розангела Майер; Дельгобо, Марина; Рибейру де Соуза Нето, Лауро; Сенгер, Марио Роберто; Сильва-Жуниор, Флориано Паес; Феррейра, Сабрина Баптиста; Занотто-Фильо, Алфеу; Андраде, Каролина Орта (март 2020 г.). «Эффективная идентификация новых свинцовых соединений против глиомы с помощью моделей машинного обучения». Европейский журнал медицинской химии . 189 : 111981. doi : 10.1016/j.ejmech.2019.111981 . ПМИД 31978780 . S2CID 210892159 .
^ Ашур, Мохамед-Басем А.; Ну и дела, Ширли Дж.; Гамак, Брюс Д. (ноябрь 1987 г.). «Использование 96-луночного устройства для чтения микропланшетов для измерения рутинной активности ферментов». Аналитическая биохимия . 166 (2): 353–360. дои : 10.1016/0003-2697(87)90585-9 . ПМИД 3434778 .
^ Мосманн, Тим (декабрь 1983 г.). «Быстрый колориметрический анализ роста и выживания клеток: применение к анализам пролиферации и цитотоксичности». Журнал иммунологических методов . 65 (1–2): 55–63. дои : 10.1016/0022-1759(83)90303-4 . ПМИД 6606682 .
^ Симс, ГК; Эллсуорт, TR; Малвейни, РЛ (11 ноября 2008 г.). «Микромасштабное определение неорганического азота в воде и почвенных экстрактах». Сообщения в области почвоведения и анализа растений . 26 (1–2): 303–316. дои : 10.1080/00103629509369298 .
^ Гринан, Н.С.; Малвейни, РЛ; Симс, ГК (11 ноября 2008 г.). «Микромасштабный метод колориметрического определения мочевины в почвенных экстрактах» . Сообщения в области почвоведения и анализа растений . 26 (15–16): 2519–2529. дои : 10.1080/00103629509369465 .
^ Тор, Джейсон М.; Сюй, Кайфэнь; Стуки, Джозеф М.; Вандер, Мишель М.; Симс, Джеральд К. (август 2000 г.). «Деградация трифлуралина в условиях микробиологического восстановления нитрата и железа (III)». Экологические науки и технологии . 34 (15): 3148–3152. Бибкод : 2000EnST...34.3148T . дои : 10.1021/es9912473 .
^ Д'Анджело, Элиза; Кратчфилд, Дж.; Вандивьер, М. (ноябрь 2001 г.). «Быстрое, чувствительное, микромасштабное определение фосфатов в воде и почве». Журнал качества окружающей среды . 30 (6): 2206–2209. дои : 10.2134/jeq2001.2206 . ПМИД 11790034 .
^ Рейн, Эд; Малвейни, РЛ; Пратт, Э.Дж.; Симс, ГК (1998). «Улучшение реакции Бертло для определения аммония в почвенных экстрактах и воде». Журнал Американского общества почвоведения . 62 (2): 473. Бибкод : 1998SSASJ..62..473R . дои : 10.2136/sssaj1998.03615995006200020026x .
^ Линь, Кедан; Саде, Вольфганг; Марк Куиллан, Дж. (Февраль 1999 г.). «Быстрые измерения внутриклеточного кальция с помощью устройства для считывания флуоресцентных пластинок» . БиоТехники . 26 (2): 318–326. дои : 10.2144/99262rr02 . ПМИД 10023544 .
^ Линь, Кедан; Саде, Вольфганг; Марк Куиллан, Дж. (Февраль 1999 г.). «Быстрые измерения внутриклеточного кальция с помощью устройства для считывания флуоресцентных пластинок» . БиоТехники . 26 (2): 318–326. дои : 10.2144/99262rr02 . ПМИД 10023544 .
^ Ашур, Мохамед-Басем А.; Ну и дела, Ширли Дж.; Гамак, Брюс Д. (ноябрь 1987 г.). «Использование 96-луночного устройства для чтения микропланшетов для измерения рутинной активности ферментов». Аналитическая биохимия . 166 (2): 353–360. дои : 10.1016/0003-2697(87)90585-9 . ПМИД 3434778 .
^ «АльфаСкрин | БМГ ЛАБТЕХ» .
^ Супрун, Мария; Геттс, Роберт; Рагунатан, Рохит; Гришина, Галина; Уитмер, Марк; Хименес, Густаво; Сэмпсон, Хью А.; Суарес-Фариньяс, Майте (5 декабря 2019 г.). «Новый анализ эпитопов на основе шариков — это чувствительный и надежный инструмент для определения профиля репертуара эпитоп-специфических антител при пищевой аллергии» . Научные отчеты . 9 (1): 18425. Бибкод : 2019NatSR...918425S . дои : 10.1038/s41598-019-54868-7 . ПМЦ 6895130 . ПМИД 31804555 .
^ Шин, Хе Джи; Квак, Минджон; Джу, Сихва; Ли, Джи Юн (2022). «Количественная оценка поглощения флуоресцентных наночастиц клетками млекопитающих с использованием планшет-ридера» . Научные отчеты . 12 (1): 20146. Бибкод : 2022NatSR..1220146S . дои : 10.1038/s41598-022-24480-3 . ПМЦ 9684140 . ПМИД 36418509 .

[1] Невес, Бруно Младший; Агнес, Джонатан Пауло; Гомес, Марсело ду Насименту; Энрикес Донса, Марсио Роберто; Гонсалвес, Розангела Майер; Дельгобо, Марина; Рибейру де Соуза Нето, Лауро; Сенгер, Марио Роберто; Сильва-Жуниор, Флориано Паес; Феррейра, Сабрина Баптиста; Занотто-Фильо, Алфеу; Андраде, Каролина Орта (март 2020 г.). «Эффективная идентификация новых свинцовых соединений против глиомы с помощью моделей машинного обучения». Европейский журнал медицинской химии . 189 : 111981. doi : 10.1016/j.ejmech.2019.111981 . ПМИД 31978780 . S2CID 210892159 .

[Mohamed-Bassem-2] Ашур, Мохамед-Басем А.; Ну и дела, Ширли Дж.; Гамак, Брюс Д. (ноябрь 1987 г.). «Использование 96-луночного устройства для чтения микропланшетов для измерения рутинной активности ферментов». Аналитическая биохимия . 166 (2): 353–360. дои : 10.1016/0003-2697(87)90585-9 . ПМИД 3434778 .

[pmid6606682-3] Мосманн, Тим (декабрь 1983 г.). «Быстрый колориметрический анализ роста и выживания клеток: применение к анализам пролиферации и цитотоксичности». Журнал иммунологических методов . 65 (1–2): 55–63. дои : 10.1016/0022-1759(83)90303-4 . ПМИД 6606682 .

[4] Симс, ГК; Эллсуорт, TR; Малвейни, РЛ (11 ноября 2008 г.). «Микромасштабное определение неорганического азота в воде и почвенных экстрактах». Сообщения в области почвоведения и анализа растений . 26 (1–2): 303–316. дои : 10.1080/00103629509369298 .

[5] Гринан, Н.С.; Малвейни, РЛ; Симс, ГК (11 ноября 2008 г.). «Микромасштабный метод колориметрического определения мочевины в почвенных экстрактах» . Сообщения в области почвоведения и анализа растений . 26 (15–16): 2519–2529. дои : 10.1080/00103629509369465 .

[6] Тор, Джейсон М.; Сюй, Кайфэнь; Стуки, Джозеф М.; Вандер, Мишель М.; Симс, Джеральд К. (август 2000 г.). «Деградация трифлуралина в условиях микробиологического восстановления нитрата и железа (III)». Экологические науки и технологии . 34 (15): 3148–3152. Бибкод : 2000EnST...34.3148T . дои : 10.1021/es9912473 .

[7] Д'Анджело, Элиза; Кратчфилд, Дж.; Вандивьер, М. (ноябрь 2001 г.). «Быстрое, чувствительное, микромасштабное определение фосфатов в воде и почве». Журнал качества окружающей среды . 30 (6): 2206–2209. дои : 10.2134/jeq2001.2206 . ПМИД 11790034 .

[8] Рейн, Эд; Малвейни, РЛ; Пратт, Э.Дж.; Симс, ГК (1998). «Улучшение реакции Бертло для определения аммония в почвенных экстрактах и воде». Журнал Американского общества почвоведения . 62 (2): 473. Бибкод : 1998SSASJ..62..473R . дои : 10.2136/sssaj1998.03615995006200020026x .

[9] Линь, Кедан; Саде, Вольфганг; Марк Куиллан, Дж. (Февраль 1999 г.). «Быстрые измерения внутриклеточного кальция с помощью устройства для считывания флуоресцентных пластинок» . БиоТехники . 26 (2): 318–326. дои : 10.2144/99262rr02 . ПМИД 10023544 .

[10] Линь, Кедан; Саде, Вольфганг; Марк Куиллан, Дж. (Февраль 1999 г.). «Быстрые измерения внутриклеточного кальция с помощью устройства для считывания флуоресцентных пластинок» . БиоТехники . 26 (2): 318–326. дои : 10.2144/99262rr02 . ПМИД 10023544 .

[11] Ашур, Мохамед-Басем А.; Ну и дела, Ширли Дж.; Гамак, Брюс Д. (ноябрь 1987 г.). «Использование 96-луночного устройства для чтения микропланшетов для измерения рутинной активности ферментов». Аналитическая биохимия . 166 (2): 353–360. дои : 10.1016/0003-2697(87)90585-9 . ПМИД 3434778 .

[12] «АльфаСкрин | БМГ ЛАБТЕХ» .

[13] Супрун, Мария; Геттс, Роберт; Рагунатан, Рохит; Гришина, Галина; Уитмер, Марк; Хименес, Густаво; Сэмпсон, Хью А.; Суарес-Фариньяс, Майте (5 декабря 2019 г.). «Новый анализ эпитопов на основе шариков — это чувствительный и надежный инструмент для определения профиля репертуара эпитоп-специфических антител при пищевой аллергии» . Научные отчеты . 9 (1): 18425. Бибкод : 2019NatSR...918425S . дои : 10.1038/s41598-019-54868-7 . ПМЦ 6895130 . ПМИД 31804555 .

[14] Шин, Хе Джи; Квак, Минджон; Джу, Сихва; Ли, Джи Юн (2022). «Количественная оценка поглощения флуоресцентных наночастиц клетками млекопитающих с использованием планшет-ридера» . Научные отчеты . 12 (1): 20146. Бибкод : 2022NatSR..1220146S . дои : 10.1038/s41598-022-24480-3 . ПМЦ 9684140 . ПМИД 36418509 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]