Иммуноанализ
| Иммуноанализ | |
|---|---|
 Иллюстрация основных компонентов иммуноанализа, который включает аналит (зеленый), антитело (черный) и обнаруживаемую метку (желтый). | |
| МеШ | D007118 |
Иммуноанализ концентрацию ( IA ) — это биохимический который измеряет наличие или ( макромолекулы тест , или небольшой молекулы в растворе с помощью антитела обычно) или антигена (иногда). Молекулу, обнаруженную с помощью иммуноанализа, часто называют « аналитом », и во многих случаях она представляет собой белок , хотя это могут быть и другие виды молекул, разных размеров и типов, при условии, что соответствующие антитела обладают необходимыми свойствами для анализ разработан. Аналиты в биологических жидкостях, таких как сыворотка или моча , часто измеряются с помощью иммуноанализа в медицинских и исследовательских целях. [1]
Иммуноанализы бывают разных форматов и вариаций. Иммуноанализы можно проводить в несколько этапов, при этом реагенты добавляются, смываются или разделяются на разных этапах анализа. Многоэтапные анализы часто называют разделительными иммуноанализами или гетерогенными иммуноанализами. Некоторые иммуноанализы можно проводить, просто смешивая реагенты и образцы и проводя физические измерения. Такие анализы называются гомогенными иммуноанализами или реже неразделительными иммуноанализами.
В иммуноанализах часто применяют калибратор. Калибраторами являются растворы, о которых известно, что они содержат рассматриваемый аналит, и концентрация этого аналита общеизвестна. Сравнение ответа анализа с реальным образцом с ответом анализа, создаваемого калибраторами, позволяет интерпретировать силу сигнала с точки зрения присутствия или концентрации аналита в образце.
Принцип
[ редактировать ]Иммуноанализы основаны на способности антитела распознавать и связывать конкретную макромолекулу, которая может представлять собой сложную смесь макромолекул. В иммунологии конкретная макромолекула, связанная с антителом, называется антигеном , а область антигена, с которой связывается антитело, называется эпитопом .
В некоторых случаях иммуноанализ может использовать антиген для обнаружения присутствия в растворе антител, распознающих этот антиген. Другими словами, в некоторых иммуноанализах аналитом может быть антитело, а не антиген.
Помимо связывания антитела с его антигеном, другой ключевой особенностью всех иммуноанализов является возможность получения измеримого сигнала в ответ на связывание. Большинство, хотя и не все, иммуноанализов включают в себя химическое связывание антител или антигенов с какой-либо обнаруживаемой меткой. В современных иммуноанализах существует большое количество меток, которые позволяют обнаруживать различные средства. Многие метки можно обнаружить, поскольку они либо излучают излучение, либо вызывают изменение цвета раствора, либо флуоресцируют под светом, либо их можно заставить излучать свет.
История
[ редактировать ]Розалин Сассман Ялоу и Соломону Берсону приписывают разработку первых иммуноанализов в 1950-х годах. Ялоу получила Нобелевскую премию за свою работу в области иммуноанализа в 1977 году, став второй американкой, получившей эту награду. [2]
Иммуноанализы стали значительно проще в выполнении и более популярными, когда в конце 1960-х годов были продемонстрированы методы химического связывания ферментов с антителами. [3]
В 1983 году профессор Энтони Кэмпбелл [4] в Кардиффском университете заменили радиоактивный йод, используемый в иммуноанализе, на сложный эфир акридиния , который излучает собственный свет: хемилюминесценцию . Этот тип иммуноанализа в настоящее время используется примерно в 100 миллионах клинических испытаний каждый год во всем мире, что позволяет врачам измерять широкий спектр белков, патогенов и других молекул в образцах крови. [5]
К 2012 году коммерческая индустрия иммуноанализа заработала 17 000 000 000 долларов США , и считалось, что у нее есть перспективы медленного ежегодного роста в диапазоне от 2 до 3 процентов. [6]
Этикетки
[ редактировать ]В иммуноанализах используются различные метки, позволяющие обнаружить антитела и антигены. Метки обычно химически связаны или конъюгированы с желаемым антителом или антигеном.
Ферменты
[ редактировать ]Возможно, одной из самых популярных меток для иммуноанализов являются ферменты . Иммуноанализы, в которых используются ферменты, называются иммуноферментными анализами (ИФА), из которых твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и метод иммуноферментного анализа наиболее распространенными типами являются (ЭМИТ).
Ферменты, используемые в ИФА, включают пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу (AP) или глюкозооксидазу . Эти ферменты часто позволяют обнаружить, поскольку они вызывают заметное изменение цвета в присутствии определенных реагентов. В некоторых случаях эти ферменты подвергаются воздействию реагентов, которые заставляют их излучать свет или хемилюминесценцию. Существует несколько типов ИФА: прямой, непрямой, сэндвич, конкурентный. [7]
Радиоактивные изотопы
[ редактировать ]Радиоактивные изотопы можно включать в реагенты для иммуноанализа для проведения радиоиммуноанализа (РИА). Радиоактивность, испускаемая связанными комплексами антитело-антиген, может быть легко обнаружена с помощью обычных методов.
РИА были одними из первых разработанных иммуноанализов, но они вышли из моды во многом из-за сложности и потенциальных опасностей, связанных с работой с радиоактивностью. [8] [9]
репортеры ДНК
[ редактировать ]Новый подход к иммуноанализу предполагает сочетание количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT qPCR) и традиционных методов иммуноанализа. Метка, называемая иммуноколичественной ПЦР в реальном времени (iqPCR), представляет собой ДНК- зонд. [10] [11]
Флюорогенные репортеры
[ редактировать ]Флуорогенные репортеры, такие как фикоэритрин, используются в ряде современных иммуноанализов. [12] Белковые микрочипы представляют собой тип иммуноанализа, в котором часто используются флуорогенные репортеры. [13]
Электрохемилюминесцентные метки
[ редактировать ]Некоторые этикетки работают посредством электрохемилюминесценции (ECL), при которой метка излучает обнаруживаемый свет в ответ на электрический ток. [14] [15]
Иммуноанализы без меток
[ редактировать ]Хотя в иммуноанализах обычно используется какая-либо метка, существуют определенные виды анализов, которые не полагаются на метки, а вместо этого используют методы обнаружения, которые не требуют модификации или маркировки компонентов анализа. Поверхностный плазмонный резонанс является примером метода, позволяющего обнаружить связывание немеченого антитела с антигенами. [16] Другой продемонстрированный безмаркерный иммуноанализ включает измерение изменения сопротивления электрода по мере связывания с ним антигенов . [17]
Классификации и форматы
[ редактировать ]
Иммуноанализы могут проводиться в различных форматах. Как правило, иммуноанализ попадает в одну из нескольких категорий в зависимости от того, как он проводится. [18]
Конкурентные гомогенные иммуноанализы
[ редактировать ]В конкурентном гомогенном иммуноанализе немеченый аналит в образце конкурирует с меченым аналитом за связывание антитела. Затем измеряют количество меченого несвязанного аналита. Теоретически, чем больше аналита в образце, тем больше меченого аналита вытесняется и затем измеряется; следовательно, количество меченого несвязанного аналита пропорционально количеству аналита в образце.
- Иммуноанализ флуоресцентной поляризации (FPIA) измеряет сигнал поляризации флуоресценции после инкубации без разделения связанных и свободных меток. К образцу добавляются свободно меченые молекулы-аналоги аналита, и их броуновское движение отличается при связывании с большим антителом (Ab) по сравнению со свободным в растворе. Аналит конкурирует за связывание с Ab, и если меченый аналит связывается с Ab, вырабатывается сигнал. Интенсивность сигнала обратно пропорциональна концентрации аналита. [19]
- В методе иммуноферментного анализа (EMIT) свободные молекулы аналогов аналита, меченные ферментом (например, ферментом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой), конкурируют с тестируемым аналитом. Активный фермент восстанавливает НАД (нет сигнала) до НАДН (который поглощает при длине волны 340 нм), поэтому поглощение контролируют при длине волны 340 нм. Когда меченый аналит связывается с антителом, фермент становится неактивным, и свободная метка генерирует сигнал. Интенсивность сигнала прямо пропорциональна концентрации аналита. [19]
- Люминесцентный иммуноанализ каналов кислорода (LOCI) генерирует формы синглетного кислорода в микрогранулах, связанных с аналитом, и когда аналит связывается с соответствующей молекулой Ab, связанной с гранулами другого типа, аналит реагирует с синглетным кислородом, генерируя сигналы хемилюминесценции, пропорциональные концентрация комплекса аналит-Ат. [19]
- При кинетическом взаимодействии микрочастиц в растворе (KIMS) и иммуноанализа турбидиметрического ингибирования с усилением частиц (PETINIA) свободные антитела связываются с конъюгатами микрочастиц лекарственного средства с образованием агрегатов, которые абсорбируются в видимом диапазоне в отсутствие аналита. В присутствии аналита антитела связываются со свободным аналитом, предотвращая агрегацию микрочастиц и вызывая снижение поглощения. Сигнал обратно пропорционален концентрации аналита. [19]
- Иммуноанализ клонированного донора фермента (CEDIA) включает генетическую инженерию фермента (например, бета-галактозидазы) в два неактивных фрагмента: небольшой донор фермента (ED), конъюгированный с аналогом лекарственного средства, и более крупный акцептор фермента (EA). Когда два фрагмента соединяются, полный фермент превращает субстрат в расщепленный окрашенный продукт. Если присутствуют молекулы аналита лекарственного средства, они конкурируют с лекарственным средством, меченным ED, в растворе за ограниченные сайты антител. Свободный аналог лекарственного средства, меченный ED, будет связываться с ЭА, генерируя колориметрический сигнал, прямо пропорциональный количеству аналита. [19]
Конкурентные гетерогенные иммуноанализы
[ редактировать ]Как и в конкурентном гомогенном иммуноанализе, немеченое аналит в образце конкурирует с меченым аналитом за связывание антитела. В гетерогенных анализах меченый несвязанный аналит отделяется или смывается, а оставшийся меченый связанный аналит измеряется.
Одноцентровые неконкурентные иммуноанализы
[ редактировать ]При смешивании образца с мечеными антителами целевой аналит связывается с мечеными антителами. Несвязавшиеся меченые антитела смывают и измеряют связанные меченые антитела. Интенсивность сигнала прямо пропорциональна количеству аналита в образце.
Двухцентровые неконкурентные иммуноанализы
[ редактировать ]Аналит в неизвестном образце связывается с сайтом антитела, затем меченое антитело связывается с аналитом. Затем измеряют количество меченого антитела на участке. Оно будет прямо пропорционально концентрации аналита, поскольку меченое антитело не будет связываться, если аналит отсутствует в неизвестном образце. Этот тип иммуноанализа также известен как сэндвич-анализ, поскольку аналит «зажат» между двумя антителами.
Примеры
[ редактировать ]Клинические испытания
[ редактировать ]Широкий спектр медицинских тестов представляют собой иммуноанализы, называемые в данном контексте иммунодиагностикой. Многие домашние тесты на беременность представляют собой иммуноанализы, которые обнаруживают маркер беременности хорионический гонадотропин человека . [20] Точнее, это качественные тесты, которые определяют наличие ХГЧ с использованием установки латерального потока . [21] Экспресс-тест на антиген COVID -19 также является качественным тестом с латеральным потоком. [22]
Другие клинические иммуноанализы являются количественными; они измеряют суммы. Иммуноанализы могут измерять уровни CK-MB для оценки заболеваний сердца, инсулина для оценки гипогликемии , простатспецифического антигена для выявления рака простаты , а некоторые из них также используются для обнаружения и/или количественного измерения некоторых фармацевтических соединений (см. Методику иммуноферментного анализа). для более подробной информации). [23]
Тестирование на наркотики также начинается с быстрого качественного иммуноанализа. [24]
Спортивный антидопинговый анализ
[ редактировать ]Иммуноанализы используются в спортивных антидопинговых лабораториях для проверки образцов крови спортсменов на наличие запрещенного рекомбинантного гормона роста человека (rhGH, rGH, hGH, GH). [25]
Исследовать
[ редактировать ]Фотоакустический иммуноанализ
[ редактировать ]Фотоакустический иммуноанализ измеряет низкочастотные акустические сигналы, генерируемые метками металлических наночастиц . Освещенные модулированным светом на длине волны плазмонного резонанса, наночастицы генерируют сильный акустический сигнал, который можно измерить с помощью микрофона. [26] Фотоакустический иммуноанализ можно применять для тестов латерального потока, в которых используются коллоидные наночастицы. [27]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Йетисен АК (2013). «Бумажные микрофлюидные диагностические устройства для мест оказания медицинской помощи». Лаборатория на чипе . 13 (12): 2210–2251. дои : 10.1039/C3LC50169H . ПМИД 23652632 .
- ^ Ралл Дж.Э. Соломон А. Берсон . В «Биографических воспоминаниях». Национальная академия наук 1990;59:54-71. ISBN 0-309-04198-8 . Полный текст .
- ^ Лекин Р. (2005). «Имуноферментный анализ (ИФА)/иммуноферментный анализ (ИФА)» . Клин. Хим . 51 (12): 2415–8. дои : 10.1373/clinchem.2005.051532 . ПМИД 16179424 .
- ^ Профессор Энтони Кэмпбелл, доктор философии , Кардиффский университет , получено 29 декабря 2012 г.
- ^ "NPS Focus" , Создатели Rainbow , Королевское химическое общество (RSC), 2003 г. , получено 29 декабря 2012 г.
- ^ Карлсон, Брюс (15 февраля 2014 г.). «Используя возможности иммуноанализа» . Генерал инж. Биотехнология. Новости . Том. 34, нет. 4. стр. 12–13.
- ^ Айдын, Сулейман (2015). «Краткая история, принципы и типы ИФА, а также наш лабораторный опыт анализа пептидов/белков с использованием ИФА». Пептиды . 72 : 4–15. doi : 10.1016/j.peptides.2015.04.012 . ПМИД 25908411 . S2CID 36486495 .
- ^ Сьюзан Дж. Ландерс (3 апреля 2006 г.). «Тест ELISA отмечает 35 лет ответа на медицинские вопросы» . Американские медицинские новости . Проверено 9 декабря 2012 года .
- ^ «Розалин Сассман Ялоу» . America.gov. 27 апреля 2008 года . Проверено 26 июня 2010 г.
- ^ Райкович; Эль-Муалидж (2006). «Иммуноколичественная ПЦР в реальном времени для обнаружения и количественного определения энтеротоксина B Staphylococcus aureus в пищевых продуктах» . Прикладная и экологическая микробиология . 72 (10): 6593–9. Бибкод : 2006ApEnM..72.6593R . дои : 10.1128/АЕМ.03068-05 . ПМК 1610299 . ПМИД 17021210 .
- ^ Гоффлот; Эль (2004). «Иммуно-количественная полимеразная цепная реакция для обнаружения и количественного определения прионного белка». Журнал иммуноанализа и иммунохимии . 25 (3): 241–58. дои : 10.1081/ias-200028044 . ПМИД 15461386 . S2CID 37548553 .
- ^ «Технология Люминекс xMAP» . Корпорация Миллипор . Проверено 13 декабря 2012 г.
- ^ Чаттерджи; Ситараман (2008). «Белковые микрочипы по требованию: новая система белковых микрочипов» . ПЛОС ОДИН . 3 (9): е3265. Бибкод : 2008PLoSO...3.3265C . дои : 10.1371/journal.pone.0003265 . ПМЦ 2533396 . ПМИД 18813342 .
- ^ Занут, А.; Фиорани, А.; Канола, С.; Сайто, Т.; Зибарт, Н.; Рапино, С.; Ребеккани, С.; Барбон, А.; Ири, Т.; Джозель, Х.; Негри, Ф.; Маркаччо, М.; Виндфур, М.; Имаи, К.; Валенти, Г.; Паолуччи, Ф. (2020). «Понимание механизма электрохемилюминесценции сореагента, способствующего повышению биоаналитических показателей» . Нат. Коммун . 11 (1): 2668. Бибкод : 2020NatCo..11.2668Z . дои : 10.1038/s41467-020-16476-2 . ПМК 7260178 . ПМИД 32472057 .
- ^ Форстер Р.Дж., Бертончелло П., Киз Т.Е. (2009). «Электрогенерированная хемилюминесценция». Ежегодный обзор аналитической химии . 2 : 359–85. Бибкод : 2009ARAC....2..359F . doi : 10.1146/annurev-anchem-060908-155305 . ПМИД 20636067 .
- ^ Х.Б. Гонсалес-Диас; и др. (2008). «Плазмонные наносэндвичи Au/Co/Au с повышенной магнитооптической активностью». Маленький . 4 (2): 202–5. дои : 10.1002/smll.200700594 . hdl : 10261/17402 . ПМИД 18196506 . S2CID 206490102 .
- ^ Георгиос Цекенис (2008). «Иммуносенсорный анализ без меток для определения основного белка миелина на основе протокола импеданса переменного тока». Аналитическая химия . 80 (6): 2058–62. дои : 10.1021/ac702070e . ПМИД 18260654 .
- ^ Голдис, Ева (24 августа 2009 г.). Применение флуоресценции в биотехнологии и науках о жизни . Уайли-Блэквелл . п. 311. ИСБН 978-0470083703 . Проверено 11 декабря 2012 г. Лицензия: «CC BY 4.0».
- ^ «ИФА для домашнего теста на беременность» . Архивировано из оригинала 21 сентября 2017 года . Проверено 11 декабря 2012 г.
- ^ Батлер, С.А. (2001). «Обнаружение ранних форм хорионического гонадотропина человека при беременности домашними тестами на беременность» . Клиническая химия . 47 (12): 2131–6. дои : 10.1093/clinchem/47.12.2131 . ПМИД 11719477 .
- ^ Гульельми Дж. (сентябрь 2020 г.). «Быстрые тесты на коронавирус: что можно и чего нельзя». Природа . 585 (7826): 496–498. Бибкод : 2020Natur.585..496G . дои : 10.1038/d41586-020-02661-2 . ПМИД 32939084 . S2CID 221768935 .
- ^ Твайман, SA (2001). «Иммуноанализы, приложения: Clinica» (PDF) . Энциклопедия аналитической науки . 4 : 317–324. Архивировано из оригинала (PDF) 24 марта 2012 года . Проверено 11 декабря 2012 г.
- ^ «Принципы технологии тестирования на наркотики», Drug Tests Direct , получено онлайн 7 декабря 2012 г.
- ^ Цивоу М; Киукия-Фугия Н; Лирис Э; Аггелис Ю; Фрагкаки А; Киуси Икс? Симицек Ph; Димопулу Х; Леонтиу ИП? Стаму М; Спиридаки М.Х.; Георгакопулос С (2006). «Обзор анализа допинг-контроля во время Олимпийских игр 2004 года в Афинах, Греция». Аналитика Химика Акта . 555 : 1–13. дои : 10.1016/j.aca.2005.08.068 .
- ^ Чжао Ю, Цао М, Макклелланд Дж. Ф., Лу М (2016). «Фотоакустический иммуноанализ для обнаружения биомаркеров». Биосенсоры и биоэлектроника . 85 : 261–66. дои : 10.1016/j.bios.2016.05.028 . ПМИД 27183276 .
- ^ Чжао Ю, Хуан Ю, Чжао X, Макклелланд Дж. Ф., Лу М (2016). «Фотоакустический анализ на основе наночастиц для высокочувствительных анализов бокового потока». Наномасштаб . 8 (46): 19204–19210. дои : 10.1039/C6NR05312B . ПМИД 27834971 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]«Справочник по иммуноанализу», 3-е издание, Дэвид Уайлд, редактор, Elsevier, 2008 г.
- Иммуноанализ в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
- Главы 5 и 6 в книге Сьюзен Р. Миккельсен «Биоаналитическая химия».
| Базы данных органов управления : Национальные |
|---|
