Количественное определение нуклеиновой кислоты

В молекулярной биологии количественный анализ нуклеиновых кислот обычно проводится для определения средних концентраций ДНК или РНК, присутствующих в смеси, а также их чистоты. Реакции, в которых используются нуклеиновые кислоты, часто требуют определенных количеств и чистоты для оптимальной эффективности. На сегодняшний день существует два основных подхода, используемых учеными для количественного определения или установления концентрации нуклеиновых кислот (таких как ДНК или РНК) в растворе. Это спектрофотометрическое количественное определение и УФ-флуоресцентное мечение в присутствии красителя ДНК. ^{[ нужна ссылка ]}

Спектрофотометрический анализ

Одним из наиболее часто используемых методов количественного определения ДНК или РНК является использование спектрофотометрического анализа с использованием спектрофотометра . ^{[ 1 ]} Спектрофотометр присутствующих способен определить средние концентрации нуклеиновых кислот ДНК или РНК, в смеси, а также их чистоту.

Спектрофотометрический анализ основан на том принципе, что нуклеиновые кислоты поглощают ультрафиолетовый свет по определенной схеме. В случае ДНК и РНК образец подвергается воздействию ультрафиолетового света с длиной волны 260 нанометров (нм), а фотодетектор измеряет свет, проходящий через образец. Часть ультрафиолетового света пройдет, а часть будет поглощена ДНК/РНК. Чем больше света поглощается образцом, тем выше концентрация нуклеиновой кислоты в образце. В результате на фотодетектор попадает меньше света , что приводит к более высокой оптической плотности (ОП).

Используя закон Бера-Ламберта, можно связать количество поглощаемого света с концентрацией поглощающей молекулы. При длине волны 260 нм средний коэффициент экстинкции двухцепочечной ДНК составляет 0,020 (мкг/мл). ⁻¹ см ⁻¹, для одноцепочечной ДНК – 0,027 (мкг/мл) ⁻¹ см ⁻¹, для одноцепочечной РНК – 0,025 (мкг/мл) ⁻¹ см ⁻¹ а для коротких одноцепочечных олигонуклеотидов это зависит от длины и состава оснований. Таким образом, поглощение (А), равное 1, соответствует концентрации 50 мкг/мл для двухцепочечной ДНК. Этот метод расчета действителен для значений А не ниже 2. ^{[ 2 ]} Для олигонуклеотидов может потребоваться более точный коэффициент экстинкции; их можно предсказать с помощью модели ближайшего соседа . ^{[ 3 ]}

Расчеты

Оптическая плотность ^{[ 4 ]} генерируется из уравнения:

Оптическая плотность = Log (Интенсивность падающего света / Интенсивность
Проходящий свет)

С практической точки зрения образец, не содержащий ДНК или РНК, не должен
поглощают любой ультрафиолетовый свет и, следовательно, производят OD, равный 0.

Оптическая плотность= Log (100/100)=0

При использовании спектрофотометрического анализа для определения концентрации ДНК или РНК закон Бера-Ламберта используется для определения неизвестных концентраций без необходимости использования стандартных кривых. По сути, закон Бера-Ламберта позволяет связать количество поглощаемого света с концентрацией поглощающей молекулы. Следующие коэффициенты преобразования единиц поглощения в концентрацию нуклеиновой кислоты используются для преобразования ОП в концентрацию неизвестных образцов нуклеиновой кислоты: ^{[ 5 ]}

A260 дцДНК = 50 мкг/мл

оцДНК A260 = 33 мкг/мл

ОцРНК A260 = 40 мкг/мл

Коэффициенты пересчета

10 мм При использовании длины пути просто умножьте ОП на коэффициент преобразования, чтобы определить концентрацию. Например, образец дцДНК с OD 2,0 соответствует образцу с концентрацией 100 мкг/мл.

При использовании длины пути менее 10 мм результирующий наружный диаметр будет уменьшен в 10 раз на длину пути. Используя приведенный выше пример с длиной пути 3 мм, ОП для образца 100 мкг/мл будет снижена до 0,6. Для нормализации концентрации до 10 мм эквивалента делают следующее:

0,6 OD X (10/3) * 50 мкг/мл = 100 мкг/мл

Большинство спектрофотометров позволяют выбирать тип нуклеиновой кислоты и длину пути так, чтобы результирующая концентрация была нормализована до длины пути 10 мм, что основано на принципах закона Бера .

A260 как измерение количества

«Единица А260» используется как мера количества нуклеиновых кислот. Одна единица А260 представляет собой количество нуклеиновой кислоты, содержащейся в 1 мл и дающей ОП, равную 1. Применяются те же коэффициенты пересчета, и поэтому в таких контекстах:

1 единица дцДНК A260 = 50 мкг

1 единица оцДНК А260 = 33 мкг

1 единица оцРНК А260 = 40 мкг

Чистота образца (соотношение 260:280/260:230)

Образцы нуклеиновых кислот часто бывают загрязнены другими молекулами (например, белками, органическими соединениями и т. д.). Вторичным преимуществом использования спектрофотометрического анализа для количественного определения нуклеиновых кислот является возможность определения чистоты образца с использованием расчета 260:280 нм. Соотношение оптической плотности при 260 и 280 нм (А _260/280 ) используют для оценки чистоты нуклеиновых кислот. Для чистой ДНК широко распространено мнение, что A _260/280 составляет ~1,8, но утверждается, что из-за числовых ошибок в оригинальной статье Варбурга это соответствует смеси, состоящей из 60% белка и 40% ДНК. ^{[ 6 ]} Соотношение для чистой РНК А _260/280 составляет ~2,0. Эти соотношения обычно используются для оценки количества белкового загрязнения, оставшегося в результате процесса выделения нуклеиновых кислот, поскольку белки поглощают при длине волны 280 нм.

Отношение оптической плотности при 260 нм к 280 нм обычно используется для оценки загрязнения ДНК белковых растворов, поскольку белки (в частности, ароматические аминокислоты) поглощают свет при 280 нм. ^{[ 2 ]}^{[ 7 ]} Обратное, однако, неверно: чтобы существенно повлиять на соотношение 260:280 в растворе нуклеиновой кислоты, требуется относительно большое количество белкового загрязнения. ^{[ 2 ]}^{[ 6 ]}

Соотношение 260:280 имеет высокую чувствительность к загрязнению нуклеиновыми кислотами белка:

% белка	% нуклеиновой кислоты	Соотношение 260:280
100	0	0.57
95	5	1.06
90	10	1.32
70	30	1.73

Соотношение 260:280 не обеспечивает чувствительности к загрязнению белков нуклеиновыми кислотами (таблица приведена для РНК, 100% ДНК, примерно 1,8):

% нуклеиновой кислоты	% белка	Соотношение 260:280
100	0	2.00
95	5	1.99
90	10	1.98
70	30	1.94

Это различие обусловлено гораздо более высоким массовым коэффициентом ослабления нуклеиновых кислот при 260 и 280 нм по сравнению с белками. По этой причине даже при относительно высоких концентрациях белка вклад белка в поглощение 260 и 280 относительно мал. Хотя загрязнение белками нельзя надежно оценить с помощью соотношения 260:280, это также означает, что оно вносит небольшую ошибку в оценку количества ДНК.

Идентификация загрязнений

Исследование спектров проб может быть полезным для выявления наличия проблем с чистотой проб.

Таблица потенциальных факторов загрязнения ^{[ 8 ]}
Соотношение	Низкое чтение	Высокое чтение
А260/А230	Перенос углеводов (часто проблема с растениями) Остаточный фенол в результате экстракции нуклеиновых кислот Остаточный гуанидин (часто используется в наборах на основе колонок) Гликоген, используемый для осаждения.	Делаем замер на грязном постаменте. Использование неподходящего решения для измерения бланка. Холостой раствор должен иметь тот же pH и ионную силу, что и раствор образца. Пример: использование воды для холостого измерения образцов, растворенных в TE, может привести к низкому соотношению 260/230.
А260/А280	Остаточный фенол или другой реагент, связанный с протоколом экстракции. Очень низкая концентрация (< 10 нг/мкл) нуклеиновой кислоты.	Остаточная РНК после экстракции нуклеиновых кислот. * Высокие коэффициенты чистоты 260/280 обычно не указывают на какие-либо проблемы.

Другие распространенные загрязнения

Загрязнение фенолом , который обычно используется при очистке нуклеиновых кислот, может существенно исказить количественные оценки. Фенол поглощает с пиком при 270 нм и А _260/280 1,2. Препараты нуклеиновых кислот, не загрязненные фенолом, должны иметь А _260/280 около 2. ^{[ 2 ]} Загрязнение фенолом может существенно способствовать завышению концентрации ДНК.
Поглощение при 230 нм может быть вызвано загрязнением фенолят -ионом, тиоцианатами и другими органическими соединениями. Для образца чистой РНК A _230:260:280 должно быть около 1:2:1, а для образца чистой ДНК A _230:260:280 должно быть около 1:1,8:1. ^{[ 9 ]}
Поглощение при длине волны 330 нм и выше указывает на наличие частиц, загрязняющих раствор, вызывающих рассеяние света в видимом диапазоне. Значение в образце чистой нуклеиновой кислоты должно быть равно нулю. ^{[ нужна ссылка ]}
Отрицательные значения могут быть получены, если в качестве пустого используется неправильное решение. Альтернативно, эти значения могут возникать из-за флуоресценции красителя в растворе.

Анализ с использованием флуоресцентного красителя

Альтернативный метод оценки концентрации ДНК и РНК — пометить образец флуоресцентной меткой , которая представляет собой флуоресцентный краситель, используемый для измерения интенсивности красителей , которые связываются с нуклеиновыми кислотами и избирательно флуоресцируют при связывании (например, бромид этидия ). Этот метод полезен в случаях, когда концентрация слишком мала для точной оценки с помощью спектрофотометрии, а также в случаях, когда загрязняющие вещества, поглощающие длину волны 260 нм, делают невозможным точное количественное определение этим методом. Преимущество количественного флуоресцентного анализа ДНК и РНК заключается в улучшенной чувствительности по сравнению со спектрофотометрическим анализом . Однако за это повышение чувствительности приходится платить более высокой ценой за образец и более длительным процессом подготовки образца .

Есть два основных подхода к этому. «Обнаружение» предполагает помещение образца непосредственно на агарозный гель или пищевую пленку . Флуоресцентный краситель либо присутствует в агарозном геле, либо добавляется в соответствующих концентрациях к образцам на пластиковой пленке. Рядом с образцом размещается набор образцов с известными концентрациями. Затем концентрацию неизвестного образца оценивают путем сравнения с флуоресценцией этих известных концентраций. В качестве альтернативы можно пропустить образец через агарозный или полиакриламидный гель вместе с некоторыми образцами известной концентрации. Как и при точечном тесте, концентрация оценивается путем сравнения интенсивности флуоресценции с известными образцами. ^{[ 2 ]}

Если объемы проб достаточно велики для использования микропланшетов или кювет , образцы с красителем также можно количественно оценить с помощью флуоресцентного фотометра . Минимальный объем образца начинается с 0,3 мкл. ^{[ 10 ]}

На сегодняшний день не существует флуоресцентного метода определения белкового загрязнения образца ДНК, аналогичного спектрофотометрической версии 260/280 нм.

См. также

Ссылки

^ Хасс, Волкер А.Р.; Фестл, Герберт; Шляйфер, Карл Хайнц (1983). «Исследования по спектрофотометрическому определению гибридизации ДНК по скорости ренатурации». Систематическая и прикладная микробиология . 4 (2): 184–192. дои : 10.1016/S0723-2020(83)80048-4 . ISSN 0723-2020 . ПМИД 23194591 .
^ Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Сэмбрук и Рассел (2001). Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство (3-е изд.). Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор . ISBN 978-0-87969-577-4 .
^ Татауров А.В.; Ты Ю.; Овзарзи Р. (2008). «Прогнозирование ультрафиолетового спектра одноцепочечных и двухцепочечных дезоксирибонуклеиновых кислот». Биофиз. Хим . 133 (1–3): 66–70. дои : 10.1016/j.bpc.2007.12.004 . ПМИД 18201813 .
^ ИЮПАК, Сборник химической терминологии . Интернет-издание: «Поглощение».
^ «Количественное определение ДНК по поглощению УФ-излучения» . БМГ ЛАБТЕХ . Проверено 17 марта 2024 г.
^ Перейти обратно: ^а ^б Глейзель Дж. (1995). «Достоверность чистоты нуклеиновых кислот контролируется по коэффициенту поглощения 260/280». БиоТехники . 18 (1): 62–63. ПМИД 7702855 . )
^ (Сэмбрук и Рассел цитируют оригинальную статью: Варбург О. и Кристиан В. (1942). «Выделение и кристаллизация фермента енолазы». Биохим. З. 310 :384-421. )
^ «Оценка чистоты нуклеиновых кислот» (PDF) . Термо Сайентифик . Проверено 28 сентября 2016 г.
^ «Анализ ДНК или РНК с использованием длин волн: 230 нм, 260 нм, 280 нм» . Биотехнология.com. 13 января 2010 г. Архивировано из оригинала 4 марта 2012 г. Проверено 12 марта 2010 г.
^ Точность и воспроизводимость количественного определения нуклеиновых кислот

Внешние ссылки

[HussFestl1983-1] Хасс, Волкер А.Р.; Фестл, Герберт; Шляйфер, Карл Хайнц (1983). «Исследования по спектрофотометрическому определению гибридизации ДНК по скорости ренатурации». Систематическая и прикладная микробиология . 4 (2): 184–192. дои : 10.1016/S0723-2020(83)80048-4 . ISSN 0723-2020 . ПМИД 23194591 .

[molecular_cloning-2] Перейти обратно: ^а ^б ^с ^д ^и Сэмбрук и Рассел (2001). Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство (3-е изд.). Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор . ISBN 978-0-87969-577-4 .

[3] Татауров А.В.; Ты Ю.; Овзарзи Р. (2008). «Прогнозирование ультрафиолетового спектра одноцепочечных и двухцепочечных дезоксирибонуклеиновых кислот». Биофиз. Хим . 133 (1–3): 66–70. дои : 10.1016/j.bpc.2007.12.004 . ПМИД 18201813 .

[4] ИЮПАК, Сборник химической терминологии . Интернет-издание: «Поглощение».

[5] «Количественное определение ДНК по поглощению УФ-излучения» . БМГ ЛАБТЕХ . Проверено 17 марта 2024 г.

[Glasel_J._1995_62–63-6] Перейти обратно: ^а ^б Глейзель Дж. (1995). «Достоверность чистоты нуклеиновых кислот контролируется по коэффициенту поглощения 260/280». БиоТехники . 18 (1): 62–63. ПМИД 7702855 . )

[7] (Сэмбрук и Рассел цитируют оригинальную статью: Варбург О. и Кристиан В. (1942). «Выделение и кристаллизация фермента енолазы». Биохим. З. 310 :384-421. )

[8] «Оценка чистоты нуклеиновых кислот» (PDF) . Термо Сайентифик . Проверено 28 сентября 2016 г.

[9] «Анализ ДНК или РНК с использованием длин волн: 230 нм, 260 нм, 280 нм» . Биотехнология.com. 13 января 2010 г. Архивировано из оригинала 4 марта 2012 г. Проверено 12 марта 2010 г.

[10] Точность и воспроизводимость количественного определения нуклеиновых кислот

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]