Очистка нуклеиновых кислот на спин-колонке

Очистка нуклеиновых кислот на спин-колонке — это метод твердофазной экстракции, позволяющий быстро очистить нуклеиновые кислоты . Этот метод основан на том факте, что нуклеиновая кислота связывается с твердой фазой кремнезема при определенных условиях.

Процедура

Различные этапы метода — это лизис, связывание, промывка и элюирование. ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]} Более конкретно, это влечет за собой лизис клеток-мишеней с высвобождением нуклеиновых кислот , селективное связывание нуклеиновой кислоты с кремнеземной мембраной, вымывание частиц и ингибиторов, которые не связаны с кремнеземной мембраной, и элюирование нуклеиновой кислоты с конечным результатом. представляет собой очищенную нуклеиновую кислоту в водном растворе.

Для лизиса клетки (крови, ткани и т. д.) образца должны пройти обработку, позволяющую разрушить клеточную мембрану и высвободить нуклеиновую кислоту. В зависимости от целевого материала это может включать использование детергента или других буферов, протеиназ или других ферментов, нагревание до различного времени/температуры или механическое разрушение, такое как резка ножом или гомогенизатором , использование ступки и пестика или измельчение шариками. отбивание бисерной мельницей.

Для связывания буферный раствор к лизированному образцу затем добавляют вместе с этанолом или изопропанолом . Затем образец в связующем растворе переносится в центрифужную колонку , а колонку помещают либо в центрифугу , либо в вакуум. Центрифуга/вакуум проталкивает раствор через кремнеземную мембрану, находящуюся внутри спин-колонки, где при правильных ионных условиях нуклеиновые кислоты связываются с кремнеземной мембраной по мере прохождения остальной части раствора. Когда целевой материал связан, проток можно устранить.

Для промывки в колонку добавляют новый буфер, затем центрифугируют/вакуумируют через мембрану. Этот буфер предназначен для поддержания условий связывания, удаляя при этом связывающие соли и другие оставшиеся загрязнения. Обычно требуется несколько промываний, часто с увеличением процентного содержания этанола/изопропанола, пока нуклеиновая кислота на кремнеземной мембране не очистится от загрязнений. Последняя «промывка» часто представляет собой сухую стадию, позволяющую спирту испариться, в результате чего на колонке остаются только очищенные нуклеиновые кислоты.

Наконец, элюирование — это процесс добавления в колонку водного раствора, позволяющий гидрофильной нуклеиновой кислоте покинуть колонку и вернуться в раствор. Этот этап можно улучшить с помощью соли, pH, времени или тепла. Наконец, чтобы захватить элюат/элюент, колонку переносят в чистую микропробирку перед последним этапом центрифугирования.

Связанные методы

Еще до появления методов нуклеиновой кислоты, используемых сегодня, было известно, что в присутствии хаотропных агентов , таких как йодид натрия или перхлорат натрия , ДНК связывается с кремнеземом, частицами стекла или одноклеточными водорослями, называемыми диатомовыми водорослями , которые защищают свои клеточные стенки кремнеземом . Это свойство было использовано для очистки нуклеиновой кислоты с использованием стеклянного порошка или шариков диоксида кремния в щелочных условиях. ^{[ 3 ]} Позже это было улучшено с использованием тиоцианата гуанидиния или гидрохлорида гуанидиния в качестве хаотропного агента. ^{[ 4 ]} Для простоты использования стеклянные шарики позже были заменены колонками из диоксида кремния. А чтобы можно было использовать автоматизированные инструменты для экстракции, были разработаны парамагнитные шарики, покрытые диоксидом кремния, которые чаще называют экстракцией «магнитных шариков».

См. также

Ссылки

^ Мэтсон, Роберт С. (2008). Методы и протоколы микрочипов . Бока-Ратон, Флорида: CRC. стр. 27–29. ISBN 978-1420046656 .
^ Кумар, Анил (2006). Генная инженерия . Нью-Йорк: Издательство Nova Science. стр. 101–102. ISBN 159454753X .
^ Марко М.А., Чипперфилд Р., Бирнбойм ХК. Процедура крупномасштабного выделения высокоочищенной плазмидной ДНК с использованием щелочной экстракции и связывания со стеклянным порошком. Анальная биохимия. Апрель 1982 г.; 121 (2): 382-7. ПМИД 6179438
^ Бум Р., Сол С.Дж., Салиманс М.М., Янсен К.Л., Вертхайм-ван Диллен П.М., ван дер Ноордаа Дж. Быстрый и простой метод очистки нуклеиновых кислот. J Clin Микробиол. 1990 март;28(3):495-503. ПМИД 1691208

[1] Мэтсон, Роберт С. (2008). Методы и протоколы микрочипов . Бока-Ратон, Флорида: CRC. стр. 27–29. ISBN 978-1420046656 .

[2] Кумар, Анил (2006). Генная инженерия . Нью-Йорк: Издательство Nova Science. стр. 101–102. ISBN 159454753X .

[3] Марко М.А., Чипперфилд Р., Бирнбойм ХК. Процедура крупномасштабного выделения высокоочищенной плазмидной ДНК с использованием щелочной экстракции и связывания со стеклянным порошком. Анальная биохимия. Апрель 1982 г.; 121 (2): 382-7. ПМИД 6179438

[4] Бум Р., Сол С.Дж., Салиманс М.М., Янсен К.Л., Вертхайм-ван Диллен П.М., ван дер Ноордаа Дж. Быстрый и простой метод очистки нуклеиновых кислот. J Clin Микробиол. 1990 март;28(3):495-503. ПМИД 1691208

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]