Карта ограничений

Чтобы узнать о других значениях, см. Ограничение (значения) .

Карта рестрикции — это карта известных сайтов рестрикции в последовательности ДНК . Рестрикционное картирование требует использования ферментов рестрикции . В молекулярной биологии карты рестрикции используются в качестве ссылки на инженерные плазмиды или другие относительно короткие фрагменты ДНК, а иногда и для более длинной геномной ДНК. Существуют и другие способы картирования особенностей ДНК для более длинных молекул ДНК, например, картирование путем трансдукции .

Один из подходов к построению рестрикционной карты молекулы ДНК заключается в секвенировании всей молекулы и прогоне последовательности через компьютерную программу, которая найдет сайты узнавания, присутствующие для каждого известного фермента рестрикции.

было бы непомерно дорогим До того, как секвенирование было автоматизировано, секвенирование всей цепи ДНК . Чтобы найти относительные положения сайтов рестрикции на плазмиде, используется метод, включающий одинарный и двойной рестрикционный расщепления. На основании размеров полученных фрагментов ДНК можно сделать вывод о положении сайтов. Рестрикционное картирование является очень полезным методом при использовании для определения ориентации вставки в векторе клонирования путем картирования положения смещенного от центра сайта рестрикции во вставке.

Метод

Экспериментальная процедура сначала требует образца очищенной плазмидной ДНК для каждого анализа. Затем расщепление выполняется с использованием каждого выбранного фермента(ов). Полученные образцы впоследствии подвергают электрофорезу , обычно на агарозном геле.

Первым шагом после завершения электрофореза является подсчет размеров фрагментов на каждой дорожке. Сумма отдельных фрагментов должна равняться размеру исходного фрагмента, а фрагменты каждого дайджеста также должны в сумме иметь одинаковый размер друг с другом. Если размеры фрагментов не складываются должным образом, возможны две проблемы. В одном случае некоторые из более мелких фрагментов могли соскользнуть с конца геля. Это часто происходит, если гель используется слишком долго. Второй возможный источник ошибки заключается в том, что гель был недостаточно плотным и поэтому не мог разделить фрагменты близкого размера. Это приводит к отсутствию разделения фрагментов, близких по размеру. Если все расщепления производят фрагменты, которые складываются, можно сделать вывод о положении сайтов REN (эндонуклеазы рестрикции), разместив их в местах на исходном фрагменте ДНК, которые будут соответствовать размерам фрагментов, полученных всеми тремя расщеплениями.

Быстрая денатурация и ренатурация сырого препарата ДНК путем щелочного лизиса клеток

В этом методе клетки лизируются в щелочных условиях. ДНК в смеси денатурируется (цепи разделяются) за счет разрыва водородных связей между двумя цепями. Большая геномная ДНК может спутываться и оставаться денатурированной, когда pH снижается во время нейтрализации. Другими словами, нити снова соединяются беспорядочным образом, образуя случайные пары оснований. Нити круглых сверхспиральных плазмид останутся относительно близко выровненными и правильно ренатурируются. Следовательно, геномная ДНК образует нерастворимый агрегат, а сверхспиральные плазмиды останутся в растворе. За этим может последовать экстракция фенолом для удаления белков и других молекул. Затем ДНК можно подвергнуть осаждению этанолом для концентрации образца.

См. также

• Vector NTI , биоинформатическое программное обеспечение, используемое, среди прочего, для прогнозирования сайтов рестрикции вектора ДНК.
• RFLP , метод, используемый, среди прочего, для дифференциации чрезвычайно похожих геномов.