Zymoblot

Zymoblot является самой быстрой доступной микротехникой для обнаружения экспрессии генов или ферментативной активности в любом биологическом образце. Техника была изобретена профессором Эльсайдом Эльсайдом Вагихом в сотрудничестве с профессором Жаклин Флетчер из факультета патологии растений, Центр Благородного Исследовательского центра , Университет штата Оклахома , США в 1993 году. ^{[ 1 ]}

Фон

Физиологические явления, будь то на клеточном или молекулярном уровне в живых организмах, направляются либо прямо, либо косвенно с помощью ферментных реакций . Поэтому анализ ферментов в живых организмах является одним из наиболее часто выполняемых видов деятельности в современных физиологических лабораториях. Многочисленные методы ферментных анализов доступны для количественного следования ферментных реакциям. Эти методы, которые были сгруппированы в шесть категорий, а именно, спектрофотометрические , флуоресцентные , нанометрические , электрод , поляриметрические , ^{[ 2 ]} Радиобиохимический ^{[ 3 ]} без недостатков. Недавно новая качественная или, скорее, полу-количественная микро-технику, впервые описанная Wagih and Fletcher (1993), ^{[ 1 ]} и назван «Zymoblot» был введен для обнаружения активности ферментов при спироплазмах и бактериях и многих других биологических системах . ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]} Позже, методика была сделана количественной с помощью денситометрии и успешно использовалась для мониторинга активности пероксидазы у растений, инфицированных вирусом . ^{[ 6 ]}

Процедура

Всего лишь 1 мкл, или меньше образца, достаточно для обнаружения активности ферментов с помощью метода Zymoblot, поскольку цветной продукт нерастворим , накапливается в ограниченной области над местом пятна. Другие методы, основанные на колориметрии , могут потребовать больших аликвот образца, так что количество полученных растворимых продуктов достаточно большое, чтобы окрасить содержание кюветы анализа до уровня читаемого колориметрии.

Техника имеет преимущества, не разделенные какой -либо другой технике. Образцы, которые должны быть проанализированы с помощью Zymoblot, не требует диализа (процесс, который может занять дни), так как промывшие блоты в трис-буферном физиологическом регионе (TBS), прежде чем мариноваться в реакционной смеси действительно удаляет ингибиторы . В отличие от других методов, в которых образцы анализируются индивидуально, образцы, которые следует анализировать с помощью Zymoblot, обнаруживаются на одном и том же блотте, а активность фермента анализируется с той же реакционной смесью одновременно с минимизацией экспериментальных ошибок и позволяет быстро качественно сравнить. Кроме того, несколько ферментов можно проанализировать в последовательном порядке на том же блотте. То есть, если блот оказывается отрицательным для определенного фермента, его можно промыть в TBS и повторно используется для другого фермента и так далее, пока не будет получена положительная реакция для фермента. В отличие от влажных анализов (например, колориметрия), результаты, полученные Zymoblot, всегда находятся в зарегистрированном из. Это позволяет Zymoblots выполняться в одном месте, где денситометр не может быть доступен, и отправлен или отправлен в другое место для количественного анализа денситометрией. Привлечение Zymoblot в кошелек исследователя на собрание облегчает дискуссии и обмен идеями с другими учеными. В то время как иммунологически основанные на ферментативных анализах ^{[ 3 ]} который использует ферменты, специфичные антитела для непосредственного обнаружения ферментов страдают от основного недостатка измерения «общего содержания ферментов», а не общей активности ферментов, зимоблот, не является серологическим методом , не использует антитела и измеряет активность фермента, поскольку он определяет только активную технику, не использует антитела и измеряет ферменты. (функциональная) часть общего содержания фермента в образце.

Zymoblot-это анализа с конечной точкой, где энзимная реакция разрешается проходить в течение фиксированного периода времени, прежде чем останавливаться при быстрой ликвидации своего специфического субстрата . Тем не менее, методика может быть адаптирована для анализа непрерывного фермента, когда интенсивность цвета с течением времени контролируется путем инкубации сестринских пятен в течение постепенно увеличивающегося периодов времени. Когда различные образцы сравниваются на одном и том же блотте, реакцию следует остановить где -то во время линейной части курса реакции. Это можно судить по визуально, и реакция останавливается, когда различия в интенсивности цвета среди пятен очевидны, учитывая, что продолжительность линейности в некоторых ферментативных реакциях может быть действительно очень короткой.

Приложения

Техника Zymoblot проще, дешевле, более надежная и менее трудоемкая, чем все известные процедуры для ферментных анализов. Вероятно, это самый быстрый метод обнаружения ферментной активности в любом биологическом или даже небиологическом образе. Техника очень конкурентоспособна по цене со всеми коммерчески доступными наборами. Такие преимущества должны квалифицировать метод Zymoblot для широкого потенциального использования в медицине , сельском хозяйстве и промышленной биотехнологии и, в более широком смысле, в общем биотехнологии применении . Это полезно в исследованиях, включая физиологию людей, животных, растений и микроорганизмов, дифференциальную диагностику заболеваний и идентификацию патогенных микроорганизмов , биотаксономию организмов, стресс и физиология патогенеза , физиологическая основа для устойчивости к болезням , физиологии развития и скрининга на коммерчески важные энзименты и многие Другие приложения. Техника особенно полезна, когда требуется первоначальное тестирование на активность фермента. Он может быть использован в исследованиях, включающих скрининг живого организма для большого количества ферментов. Это также может быть очень удобно в изучении Распределение ферментов или тканеспецифическая экспрессия генов с точки зрения активности фермента по всему организму или на органе . Образцы, взятые из разных частей организма или органа, могут одновременно проанализировать и сравнить на одном и том же блотте, что дает четкое представление о распределении ферментной активности. С той же простотой, соответствующие ткани, взятые из обычно и биотически-абиотических стрессовых людей, можно сравнить для стимуляции или индукции ферментов. Кроме того, зимоблоты могут быть очень полезны в исследованиях цитохемодиссекции , направленных на локализацию ферментов в клетках. Клеточные фракции, представляющие различные части клетки ( ядра , митохондрии , лизосомы , пероксисомы , тела Гольджи , цитозоль , ... и т. Д.), Могут быть проверены на множество ферментов за относительно короткое время.

Качественный Zymoblot имеет большое потенциальное использование при диагностике заболеваний человека, животных и растений . Если патоген демонстрирует специфический фермент, который не разделяется его хозяином, техника может быть окончательным диагностическим инструментом. Обнаружение фермента, не известного, обычно присутствующего в образце жидкости тела (например , крови , CSF , синовиальная жидкость , молоко, разрывы ... и т. Д.) Использование качественного зимоблот является признаком физиологического расстройства , воспалительной реакции или или патогенная инфекция . Во всех этих ситуациях количественный зимоблот может быть использован для определения серьезности проблемы. Аналогичным образом, замена биологических жидкостей небиологическими жидкостями, взятыми из водоемов (или полученных из аналогичных источников окружающей среды) в разных местах или глубине в разное время позволит Zymoblot путем обнаружения активности фермента, выявить или контролировать микробную нагрузку и, следовательно, определить уровень загрязнения в этих источниках.

Ссылки

^ Подпрыгнуть до: ^а ^{беременный} Wagih, Elsayed E.; Флетчер, Жаклин (1993). «Zymoblot, новая микротехника, используемая для обнаружения ферментной активности при спироплазмах и бактериях». Канадский журнал микробиологии . 39 (5): 543–547. doi : 10.1139/m93-077 . Wagih, EE и Fletcher, J. (1993). Zymoblot, новая микротехника, используемая для обнаружения активности ферментов при спироплазмах и бактериях. Канадский журнал микробиологии 39: 543-547.
^ Dixon, M. and Webb, EC (1979). Ферменты. 3 -е изд. Longman Group Ltd. 1116pp.
^ Подпрыгнуть до: ^а ^{беременный} Wiseman, A. [ed.] (1983). Темы Фермента и Ферментации Biotechnology 7. Ellis Horwood Ltd. 314pp.
^ Wagih, EE и Wagih, ME (1996). Техника Zymoblot: потенциал в физиологии растений. Прокурор 2-я Азиатско-Тихоокеанская конференция по физиологии растений, Шах Алам, Куала-Лумпур, Малайзия, 20–22 августа 1996 года.
^ Wagih, ME, Onwueme, IC and Wagih, EE (1996). Обнаружение экспрессии гена дифференциальной пероксидазы в Taro (Colocasia esculenta L. Scotts) с использованием метода Zymoblot. Во 2 -м Международном конгрессе науки о урожаях. Нью -Дели, Индия, 17–24 ноября 1996 г.
^ Wagih, EE и Wagih, ME (1997). Количественные методы зимоблот и белкового блока и их использование в мониторинге общих ферментов и растворимых белковых изменений при инфекциях вируса растений Proc. 1 -й конференция по науке о урожаях Африки, Претория, Республика Южная Африка, 13–17 января 1997 года.

Внешние ссылки

[1]
[2]

[Wagih1993-1] Подпрыгнуть до: ^а ^{беременный} Wagih, Elsayed E.; Флетчер, Жаклин (1993). «Zymoblot, новая микротехника, используемая для обнаружения ферментной активности при спироплазмах и бактериях». Канадский журнал микробиологии . 39 (5): 543–547. doi : 10.1139/m93-077 . Wagih, EE и Fletcher, J. (1993). Zymoblot, новая микротехника, используемая для обнаружения активности ферментов при спироплазмах и бактериях. Канадский журнал микробиологии 39: 543-547.

[2] Dixon, M. and Webb, EC (1979). Ферменты. 3 -е изд. Longman Group Ltd. 1116pp.

[Wiseman-3] Подпрыгнуть до: ^а ^{беременный} Wiseman, A. [ed.] (1983). Темы Фермента и Ферментации Biotechnology 7. Ellis Horwood Ltd. 314pp.

[4] Wagih, EE и Wagih, ME (1996). Техника Zymoblot: потенциал в физиологии растений. Прокурор 2-я Азиатско-Тихоокеанская конференция по физиологии растений, Шах Алам, Куала-Лумпур, Малайзия, 20–22 августа 1996 года.

[5] Wagih, ME, Onwueme, IC and Wagih, EE (1996). Обнаружение экспрессии гена дифференциальной пероксидазы в Taro (Colocasia esculenta L. Scotts) с использованием метода Zymoblot. Во 2 -м Международном конгрессе науки о урожаях. Нью -Дели, Индия, 17–24 ноября 1996 г.

[6] Wagih, EE и Wagih, ME (1997). Количественные методы зимоблот и белкового блока и их использование в мониторинге общих ферментов и растворимых белковых изменений при инфекциях вируса растений Proc. 1 -й конференция по науке о урожаях Африки, Претория, Республика Южная Африка, 13–17 января 1997 года.

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]