Кассета без G

Анализ транскрипции кассеты без G — это метод, используемый в молекулярной биологии для определения промотора силы in vitro . Этот метод включает количественную оценку продукта мРНК с использованием плазмиды. ^{[ 1 ]} Кассета без G является частью предварительно сконструированного вектора, обычно содержащего сайт множественного клонирования (MCS) перед кассетой. По этой причине интересующие промоторы могут быть вставлены непосредственно в MCS, чтобы в конечном итоге измерить точность и эффективность промотора в рекрутировании транскрипционного аппарата.

Промотор клонируется в
Кассетная плазмида G-less.
**(а)** Предварительно полученную плазмиду с смысловой цепью длиной 365 нуклеотидов, не содержащей G, подвергают вставке промотора. **(б)** Промотор клонируют в сайт множественного клонирования (MCS) непосредственно перед сайтом начала транскрипции. Для транскрипции кассеты без G используется полимераза. Как только кассета транскрибируется и первый гуанозинтрифосфат обнаруживается в смысловой цепи за кассетой, транскрипция преждевременно прекращается. Высвобождается радиоактивно меченный транскрипт длиной 365 нт. Транскрипты, полученные с помощью кассетного анализа без G, можно подвергнуть гель-электрофорезу для подтверждения их длины и авторадиографии для определения относительной силы промотора.

Метод

Кассета без G представляет собой репортерный ген , который кодирует транскрипт, в котором отсутствуют гуаниновые нуклеотиды в смысловой цепи ДНК (отсюда и « G -less»). ^{[ 2 ]} Плазмида, содержащая такой ген, расположена ниже MCS. После того, как промотор вставлен в MCS, транскрипция продолжается с добавлением меченных радиоактивным изотопом UTP, CTP и АТФ (а также немеченных радиоактивным изотопом/холодных нуклеотидов) и продолжается до тех пор, пока не будет достигнут конец кассеты без G и не будут обнаружены остатки гуанина. еще раз проявляется в смысловой цепи ДНК. Отсутствие GTP in vitro приводит к преждевременному прекращению транскрипции на первом остатке гуанина в смысловой цепи, следующей за кассетой. Гель-электрофорез проводят на продуктах транскрипции, а количество радиоактивности определяют количественно с помощью авторадиографии или фосфорной визуализации для определения силы интересующего промотора.

Приложение

Метод G-less кассеты используется для определения силы промотора за пределами базальных уровней транскрипции (т.е. в присутствии активаторов транскрипции или факторов транскрипции). ^{[ 3 ]}). Например, для измерения эффектов ТАТА-бокса модификации консенсусной последовательности в Saccharomyces cerevisiae в присутствии TFIID были внедрены кассеты без G для измерения относительной силы каждого промотора. ^{[ 4 ]}

Преимущества

Анализ G-less можно провести на кольцевой плазмиде для измерения уровней транскрипции. Кольцевая плазмида обеспечивает более эффективную матрицу во многих системах по сравнению с другими анализами, такими как транскрипция стока, в которых требуется расщепленный конец. Этот метод очень эффективно генерирует транскрипты с радиоактивной меткой, поскольку он позволяет избежать ненужного процесса выполнения других косвенных измерений продукта мРНК. Промотор вставляется в кольцевую плазмиду, содержащую кассету без G, которая генерирует транскрипт определенной длины, исключающий случайную и неспецифическую транскрипцию по всей плазмиде. Большинство грубых систем, таких как ядерные экстракты HeLa, используются, поскольку они содержат небольшое количество примеси GTP, которая приводит к фоновой транскрипции и может иногда вызывать случайное чтение транскрипции через кассету без G. ^{[ 5 ]}

Ссылки

^ Парк, Дж. Х.; Маган, Н. (12 ноября 2014 г.). «Количественный ПЦР в реальном времени с обратной транскриптазой-анализ бесклеточной транскрипции на собранном в хроматине промоторе p21» . ПЛОС ОДИН . 6 (8): e23617. дои : 10.1371/journal.pone.0023617 . ПМК 3160311 . ПМИД 21886803 .
^ Ария Баниахмад (2002). Рецепторы гормонов щитовидной железы: методы и протоколы . Springer Science & Business Media. п. 211. ИСБН 978-1-59259-174-9 .
^ Казеруниния, А; Нго, Б; Мартинсон, ХГ (12 ноября 2014 г.). «Поли(А)-зависимая деградация непроцессированных возникающих транскриптов сопровождает поли(А)-зависимую транскрипционную паузу in vitro» . РНК . 16 (1): 197–210. дои : 10.1261/rna.1622010 . ПМК 2802029 . ПМИД 19926725 .
^ Бьернсдоттир, Г; Майерс, Л.К. (12 ноября 2014 г.). «Минимальные компоненты транскрипционного аппарата РНК-полимеразы II определяют консенсусный ТАТА-бокс» . Нуклеиновые кислоты Рез . 36 (9): 2906–16. дои : 10.1093/нар/gkn130 . ПМК 2396422 . ПМИД 18385157 .
^ Кэри, МФ; Петерсон, CL; Смейл, Северная Каролина (12 ноября 2014 г.). «Транскрипция in vitro кассеты без G с использованием ядерных экстрактов клеток HeLa». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2010 (3): pdb.prot5387. дои : 10.1101/pdb.prot5387 . ПМИД 20194456 .

[1] Парк, Дж. Х.; Маган, Н. (12 ноября 2014 г.). «Количественный ПЦР в реальном времени с обратной транскриптазой-анализ бесклеточной транскрипции на собранном в хроматине промоторе p21» . ПЛОС ОДИН . 6 (8): e23617. дои : 10.1371/journal.pone.0023617 . ПМК 3160311 . ПМИД 21886803 .

[Baniahmad2002-2] Ария Баниахмад (2002). Рецепторы гормонов щитовидной железы: методы и протоколы . Springer Science & Business Media. п. 211. ИСБН 978-1-59259-174-9 .

[3] Казеруниния, А; Нго, Б; Мартинсон, ХГ (12 ноября 2014 г.). «Поли(А)-зависимая деградация непроцессированных возникающих транскриптов сопровождает поли(А)-зависимую транскрипционную паузу in vitro» . РНК . 16 (1): 197–210. дои : 10.1261/rna.1622010 . ПМК 2802029 . ПМИД 19926725 .

[4] Бьернсдоттир, Г; Майерс, Л.К. (12 ноября 2014 г.). «Минимальные компоненты транскрипционного аппарата РНК-полимеразы II определяют консенсусный ТАТА-бокс» . Нуклеиновые кислоты Рез . 36 (9): 2906–16. дои : 10.1093/нар/gkn130 . ПМК 2396422 . ПМИД 18385157 .

[5] Кэри, МФ; Петерсон, CL; Смейл, Северная Каролина (12 ноября 2014 г.). «Транскрипция in vitro кассеты без G с использованием ядерных экстрактов клеток HeLa». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2010 (3): pdb.prot5387. дои : 10.1101/pdb.prot5387 . ПМИД 20194456 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]