Тандемная аффинная очистка
Тандемная аффинная очистка ( ТАП ) — это метод очистки, основанный на иммунопреципитации , для изучения белок-белковых взаимодействий . Цель состоит в том, чтобы извлечь из клетки только интересующий белок в комплексе с любыми другими белками, с которыми он взаимодействовал. В TAP используются два типа агарозных гранул, которые связываются с интересующим белком и которые можно отделить от клеточного лизата центрифугированием, не нарушая, не денатурируя и не загрязняя вовлеченные комплексы. Чтобы интересующий белок мог связываться с гранулами, его помечают специальным фрагментом — меткой TAP.
Оригинальный метод TAP предполагает слияние метки TAP с C-концом исследуемого белка. Метка TAP состоит из трех компонентов: кальмодулин- связывающего пептида (CBP), протеазой TEV сайта расщепления и двух доменов белка А , которые прочно связываются с IgG (что делает метку TAP своего рода эпитопной меткой). [ 1 ]
С момента первой публикации принципа ТАР было предложено множество других комбинаций метка/гранулы/элюент.
Варианты тегов
[ редактировать ]Этот тег также известен как тег TAP C-терминала, поскольку с N-терминалом также доступна версия . Однако описываемый метод предполагает использование метки С-конца, хотя принцип метода остается тем же.
История
[ редактировать ]TAP-метка была изобретена исследовательской группой, работавшей в Европейской лаборатории молекулярной биологии, в конце 1990-х годов (Rigaut et al., 1999, [ 2 ] Пуч и др., 2001 г. [ 3 ] ) и предложен в качестве нового инструмента для исследования протеома. Команда использовала его для характеристики нескольких белковых комплексов (Rigaut et al., 1999, [ 2 ] Каспари и др. 1999, [ 4 ] Бувере и др., 2000, [ 5 ] Пуиг и др., 2001 г. [ 3 ] ). Первое крупномасштабное применение этого метода произошло в 2002 году, когда исследовательская группа работала в сотрудничестве с учеными протеомной компании Cellzome над созданием визуальной карты взаимодействия более чем 230 мультибелковых комплексов в дрожжевой клетке путем систематического маркировка тега TAP для каждого белка. Первый успешный отчет об использовании технологии TAP-меток на растениях появился в 2004 году (Rohila et al., 2004, [ 6 ] )
Процесс
[ редактировать ]Существует несколько способов введения слитого белка в клетки-хозяева. Если хозяином являются дрожжи , то одним из методов может быть использование плазмид , которые в конечном итоге будут транслировать слитый белок внутри хозяина. Какой бы метод ни использовался, предпочтительно поддерживать экспрессию слитого белка как можно ближе к его естественному уровню. Как только слитый белок транслируется внутри хозяина, он будет взаимодействовать с другими белками, в идеале так, чтобы на него не влияла метка TAP.
Впоследствии меченый белок (вместе с его партнерами по связыванию) извлекается с использованием процесса селекции по аффинности .
Первый тип добавленных шариков покрыт иммуноглобулином G , который связывается с внешним концом метки TAP. Гранулы с интересующими белками отделяют от лизата центрифугированием. Затем белки высвобождаются из гранул с помощью фермента ( протеазы TEV ), который разрушает метку в месте расщепления TEV в середине.
После этого первого этапа очистки к высвободившимся белкам добавляют шарики второго типа (покрытые кальмодулином ), которые обратимо связываются с оставшейся частью TAP-метки, все еще находящейся на белках. Гранулы снова отделяют центрифугированием, дополнительно удаляя примеси, а также протеазу TEV. [ 3 ] Наконец, гранулы высвобождаются EGTA , оставляя после себя нативный элюат, содержащий только интересующий белок, его связанные белки-партнеры и оставшуюся часть CBP метки TAP.
Затем нативный элюат можно проанализировать с помощью гель-электрофореза и масс-спектрометрии для идентификации партнеров по связыванию белка.
Преимущества
[ редактировать ]Преимущество этого метода заключается в том, что можно реально количественно определить партнерские белки in vivo без предварительного знания сложного состава. Он также прост в исполнении и часто обеспечивает высокую доходность. [ 3 ] Одним из препятствий изучения белок-белкового взаимодействия является загрязнение целевого белка, особенно когда у нас нет никаких предварительных знаний о нем. TAP предлагает эффективные и высокоспецифичные средства очистки целевого белка. После двух последовательных аффинных очисток вероятность сохранения примесей в элюате значительно снижается.
Недостатки
[ редактировать ]Однако существует также вероятность того, что метка, добавленная к белку, может скрыть связывание нового белка с его взаимодействующими партнерами. Кроме того, метка также может влиять на уровень экспрессии белка. С другой стороны, метка также может быть недостаточно подвержена воздействию аффинных шариков, что приводит к искажению результатов.
Также может существовать возможность расщепления белков протеазой TEV , хотя это маловероятно, учитывая высокую специфичность протеазы TEV. [ 7 ]
Пригодность
[ редактировать ]Поскольку этот метод включает как минимум 2 цикла промывки, он может не подходить для скрининга временных белковых взаимодействий , в отличие от дрожжевого двухгибридного метода или перекрестного сшивания in vivo с фотореактивными аналогами аминокислот . Тем не менее, это хороший метод для проверки стабильных белковых взаимодействий, который позволяет проводить исследования различной степени, контролируя количество раз очистки белкового комплекса. [ нужна ссылка ]
Приложения
[ редактировать ]В 2002 году метка TAP была впервые использована вместе с масс-спектрометрией в крупномасштабном подходе для систематического анализа протеомики дрожжей путем характеристики мультибелковых комплексов. [ 8 ] В ходе исследования выявлен 491 комплекс, из них 257 совершенно новые. Остальные были знакомы по другим исследованиям, но теперь практически во всех из них были обнаружены новые компоненты. Они составили карту, связывающую все белковые компоненты функционально в сложную сеть.
Многие другие протеомные анализы также включают использование метки TAP. Исследование EMBO (Dziembowski, 2004) выявило новый комплекс, необходимый для удержания и сплайсинга ядерной пре-мРНК. Они очистили новый тримерный комплекс, состоящий из трех других субъединиц (Snu17p, Bud13p и Pml1p), и обнаружили, что эти субъединицы не важны для жизнеспособности, но необходимы для эффективного сплайсинга (удаления интронов) пре-мРНК. В 2006 году Флейшер и др. систематически идентифицированные белки, связанные с рибосомными комплексами эукариот. [ 9 ] Они использовали многогранный масс-спектрометрический протеомный скрининг для идентификации рибосомальных комплексов дрожжей, а затем использовали метку TAP, чтобы функционально связать все эти белки.
Другие комбинации эпитопа и метки
[ редактировать ]Принцип тандемно-аффинной очистки мультибелковых комплексов не ограничивается комбинацией меток CBP и белка А, использованных в оригинальной работе Rigaut et al. (1999). Например, комбинация FLAG- и HA-тегов с 2000 года используется группой Накатани. [ 10 ] [ 11 ] для очистки многочисленных белковых комплексов из клеток млекопитающих. С момента публикации принципа TAP было предложено множество других комбинаций тегов.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ (2005) TAP Tag. В: Энциклопедический справочник по геномике и протеомике в молекулярной медицине. Шпрингер, Берлин, Гейдельберг. https://doi.org/10.1007/3-540-29623-9_8882
- ^ Jump up to: а б Ригот Г. и др. (1999). «Общий метод очистки белков для характеристики белковых комплексов и исследования протеома». Природная биотехнология . 17 (10): 1030–1032. дои : 10.1038/13732 . ПМИД 10504710 . S2CID 663553 .
- ^ Jump up to: а б с д Пуч, О.; и др. (2001). «Метод тандемной аффинной очистки (TAP): общая процедура очистки белкового комплекса». Методы . 24 (3): 218–229. дои : 10.1006/meth.2001.1183 . ПМИД 11403571 .
- ^ Каспари Ф. и др. (1999). «Частичная очистка дрожжевого мяРНП U2 выявила новый фактор сплайсинга дрожжевой пре-мРНК, необходимый для сборки пре-сплайсосомы» . Журнал ЭМБО . 18 (12): 3463–3474. дои : 10.1093/emboj/18.12.3463 . ПМЦ 1171425 . ПМИД 10369685 .
- ^ Бувере Э. и др. (2000). «Sm-подобный белковый комплекс, участвующий в деградации мРНК» . Журнал ЭМБО . 19 (7): 1661–1671. дои : 10.1093/emboj/19.7.1661 . ПМК 310234 . ПМИД 10747033 .
- ^ Рохила, Джай С.; Чен, Мэй; Черни, Рональд; Фромм, Майкл Э. (февраль 2004 г.). «Улучшенная тандемная аффинная метка очистки и методы выделения белковых гетерокомплексов из растений» . Заводской журнал . 38 (1): 172–181. дои : 10.1111/j.1365-313X.2004.02031.x . ПМИД 15053770 .
- ^ Догерти, У.Г., С.М. Кэри и Т.Д. Паркс (1989). «Молекулярно-генетический анализ сайта расщепления полипротеина растительного вируса: модель». Вирусология . 171 (2): 356–364. дои : 10.1016/0042-6822(89)90603-X . ПМИД 2669323 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Функциональная организация протеома дрожжей путем систематического анализа белковых комплексов , Gavin AC et al. Природа 415, 141–147 (10 января 2002 г.) | дои : 10.1038/415141a ; Поступило 15 августа 2001 г.; Принято 25 октября 2001 г.
- ^ Систематическая идентификация и функциональный скрининг неохарактеризованных белков, связанных с эукариотическими рибосомальными комплексами , doi: 10.1101/гад.1422006, Ген. Дев. 2006. 20: 1294-1307.
- ^ Икура Т и др. «Участие комплекса гистонацетилазы TIP60 в репарации ДНК и апоптозе». Клетка . 2000 102 (4): 463-73. [1]
- ^ Накатани Ю., Огрызко В. «Иммуноаффинная очистка белковых комплексов млекопитающих». Методы Энзимол . 2003 г.; 370 :430-44. [2]