TEV протеаза
| ядерное включение-эндопептидаза | |||
|---|---|---|---|
 | |||
| Идентификаторы | |||
| Номер ЕС. | 3.4.22.44 | ||
| Номер CAS. | 139946-51-3 | ||
| Базы данных | |||
| ИнтЭнк | вид IntEnz | ||
| БРЕНДА | БРЕНДА запись | ||
| Экспаси | Просмотр NiceZyme | ||
| КЕГГ | КЕГГ запись | ||
| МетаЦик | метаболический путь | ||
| ПРЯМОЙ | профиль | ||
| PDB Структуры | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||
| |||
Протеаза TEV ( EC 3.4.22.44 , эндопептидаза ядерного включения вируса травления табака ) представляет собой высокоспецифичную последовательность цистеиновую протеазу из вируса травления табака (TEV). [ 1 ] Он принадлежит к PA химотрипсиноподобных клану протеаз. [ 2 ] Благодаря своей высокой специфичности последовательности протеаза TEV часто используется для контролируемого расщепления слитых белков in vitro и in vivo . [ 3 ] Консенсусная последовательность, распознаваемая протеазой TEV, представляет собой Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-|-Ser, где «|» обозначает расщепленную пептидную связь . [ 4 ]
Источник
[ редактировать ]Вирус травления табака кодирует весь свой геном в виде одного массивного полипротеина (350 кДа). Он расщепляется на функциональные единицы тремя протеазами: протеазой P1 (1 сайт расщепления), протеазой хелперного компонента (1 сайт расщепления) и протеазой TEV (7 сайтов расщепления). [ 1 ] Нативная протеаза TEV также содержит внутренний сайт саморасщепления. Этот сайт медленно расщепляется, инактивируя фермент (физиологическая причина этого неизвестна).
Структура и функции
[ редактировать ]
Структура протеазы TEV была расшифрована методом рентгеновской кристаллографии . [ 5 ] Он состоит из двух β-цилиндров и гибкого С-концевого хвоста и демонстрирует структурную гомологию с суперсемейством протеаз химотрипсина ( клан PA , семейство C4 по классификации MEROPS ). [ 2 ] Хотя протеаза TEV гомологична клеточным сериновым протеазам (таким как трипсин , эластаза , тромбин и т. д.), она использует цистеин в качестве каталитического нуклеофила. [ 6 ] (как и многие другие вирусные протеазы).
Ковалентный катализ осуществляется с помощью триады Asp-His-Cys , разделенной между двумя стволами (Asp на β1 и His и Cys на β2). [ 7 ] Субстрат удерживается в виде β-листа, образуя антипараллельное взаимодействие с щелью между стволами и параллельное взаимодействие с С-концевым хвостом. [ 8 ] Таким образом, фермент образует туннель связывания вокруг субстрата, и взаимодействия боковой цепи контролируют специфичность. [ 5 ]
Специфика
[ редактировать ]
Предпочтительную нативную последовательность расщепления сначала идентифицировали путем исследования сайтов разреза нативного полипротеинового субстрата на наличие повторяющейся последовательности. Консенсус для этих нативных сайтов разреза - ENLYFQ\S, где '\' обозначает расщепляемую пептидную связь . [ 4 ] Остатки субстрата помечены от P6 до P1 перед местом разреза и P1' после места разреза. В ранних работах также измерялось расщепление множества подобных субстратов, чтобы охарактеризовать, насколько специфична протеаза к нативной последовательности. [ 9 ] [ 10 ]
Впоследствии в исследованиях использовалось секвенирование расщепленных субстратов из пула рандомизированных последовательностей для определения закономерностей предпочтений. [ 11 ] [ 12 ] Хотя ENLYFQ\S является оптимальной последовательностью, протеаза активна в большей или меньшей степени на ряде субстратов (т.е. демонстрирует некоторую неразборчивость субстратов ). Наибольшее расщепление имеют последовательности, наиболее близкие к консенсусу EXLYΦQ\φ, где X представляет собой любой остаток, Φ представляет собой любой крупный или средний гидрофоб и φ представляет собой любой небольшой гидрофобный или полярный остаток. Хотя эта последовательность является оптимальной, последовательности с нежелательными остатками в некоторых положениях все же можно расщепить, если остальная часть последовательности оптимальна. [ 10 ] [ 12 ]
Специфичность обеспечивается большой площадью контакта между ферментом и субстратом. Протеазы, такие как трипсин, обладают специфичностью к одному остатку до и после расщепленной связи из-за неглубокой связывающей щели только с одним или двумя карманами, которые связывают боковые цепи субстрата. И наоборот, вирусные протеазы, такие как протеаза TEV, имеют длинный С-концевой хвост, который полностью покрывает субстрат, создавая туннель связывания. Этот туннель содержит набор карманов прочного связывания, так что каждая боковая цепь пептида-субстрата (от P6 до P1') связана в комплементарном сайте (от S6 до S1'). [ 5 ]
В частности, боковая цепь пептида P6-Glu контактирует с сетью из трех водородных связей; P5-Asn направлен в растворитель, не вступая в специфические взаимодействия (следовательно, отсутствие консенсуса по субстрату в этом положении); P4-Leu скрыт в гидрофобном кармане; P3-Tyr удерживается в гидрофобном кармане с короткой водородной связью на конце; P2-Phe также окружен гидрофобами, включая лицевую часть триады гистидина; P1-Gln образует четыре водородные связи; и P1'-Ser лишь частично заключен в неглубокую гидрофобную бороздку. [ 5 ]
Применение в качестве биохимического инструмента
[ редактировать ]Одним из основных применений этого белка является удаление аффинных меток из очищенных рекомбинантных слитых белков . Причиной использования протеазы TEV в качестве биохимического инструмента является ее высокая специфичность последовательности. Эта специфичность позволяет контролировать расщепление белков, когда предпочтительная последовательность вставляется в гибкие петли. Это также делает протеазу TEV относительно нетоксичной in vivo , поскольку известная последовательность редко встречается в белках. [ 13 ]
Хотя рациональный дизайн имел ограниченный успех в изменении специфичности протеазы, направленная эволюция использовалась для изменения предпочтительного остатка либо до [ 14 ] или после [ 15 ] [ 16 ] место расщепления.
Однако протеаза TEV имеет ограничения как биохимический инструмент. Он склонен к дезактивации путем саморасщепления (аутолизу), хотя это можно устранить с помощью единственной мутации S219V во внутреннем сайте расщепления. [ 17 ] Протеаза, экспрессируемая отдельно, также плохо растворима, однако было предпринято несколько попыток улучшить ее растворимость посредством направленной эволюции и компьютерного дизайна. Также было показано, что экспрессия может быть улучшена путем слияния с белком, связывающим мальтозу (MBP), который действует как партнер, повышающий растворимость. [ 3 ]
Сообщалось, что протеаза TEV демонстрирует 10-кратную потерю активности при 4 ° C. [ 18 ] Протеаза TEV теряет активность при температуре выше 34 °C. [ 19 ] Оригинальная протеаза TEV для высокой активности требовала присутствия восстановителя, который мог нарушать функцию белков, содержащих дисульфидные связи. После включения различных мутаций более поздние версии «протеазы superTEV» обладают высокой активностью в присутствии или в отсутствие восстанавливающего агента. [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]
Молекулярная масса этого фермента варьируется от 25 до 27 кДа в зависимости от конкретной используемой конструкции.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б UniProt: Полипротеин TEV: «Р04517» .
- ^ Jump up to: а б Роулингс Н.Д., Барретт А.Дж., Бейтман А. (январь 2012 г.). «MEROPS: база данных протеолитических ферментов, их субстратов и ингибиторов» . Нуклеиновые кислоты Рез . 40 (Проблема с базой данных): D343–50. дои : 10.1093/nar/gkr987 . ПМК 3245014 . ПМИД 22086950 .
- ^ Jump up to: а б Капуст Р.Б., Во Д.С. (июль 2000 г.). «Контролируемая внутриклеточная обработка слитых белков протеазой TEV». Экспр. белка Пуриф . 19 (2): 312–8. дои : 10.1006/prep.2000.1251 . ПМИД 10873547 .
- ^ Jump up to: а б Кэррингтон Дж. К., Догерти В. Г. (май 1988 г.). «Кассета вирусного сайта расщепления: идентификация аминокислотных последовательностей, необходимых для обработки полипротеинов вируса травления табака» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 85 (10): 3391–5. Бибкод : 1988PNAS...85.3391C . дои : 10.1073/pnas.85.10.3391 . ПМК 280215 . ПМИД 3285343 .
- ^ Jump up to: а б с д Фан Дж, Зданов А, Евдокимов А.Г., Тропеа Дж.Э., Петерс Х.К., Капуст Р.Б., Ли М., Влодавер А., Во Д.С. (декабрь 2002 г.). «Структурная основа субстратной специфичности протеазы вируса травления табака» . Ж. Биол. Хим . 277 (52): 50564–72. дои : 10.1074/jbc.M207224200 . ПМИД 12377789 .
- ^ Базан Дж. Ф., Флеттерик Р. Дж. (ноябрь 1988 г.). «Вирусные цистеиновые протеазы гомологичны трипсиноподобному семейству сериновых протеаз: структурные и функциональные значения» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 85 (21): 7872–6. Бибкод : 1988PNAS...85.7872B . дои : 10.1073/pnas.85.21.7872 . ПМЦ 282299 . ПМИД 3186696 .
- ^ Догерти В.Г., Паркс Т.Д., Кэри С.М., Базан Дж.Ф., Флеттерик Р.Дж. (сентябрь 1989 г.). «Характеристика каталитических остатков протеиназы 49-кДа вируса травления табака». Вирусология . 172 (1): 302–10. дои : 10.1016/0042-6822(89)90132-3 . ПМИД 2475971 .
- ^ Тиндалл Дж.Д., Нолл Т., Фэрли Д.П. (март 2005 г.). «Протеазы повсеместно распознают бета-цепи в своих активных центрах». хим. Преподобный . 105 (3): 973–99. дои : 10.1021/cr040669e . ПМИД 15755082 .
- ^ Догерти В.Г., Кэри С.М., Паркс Т.Д. (август 1989 г.). «Молекулярно-генетический анализ сайта расщепления полипротеина растительного вируса: модель». Вирусология . 171 (2): 356–64. дои : 10.1016/0042-6822(89)90603-X . ПМИД 2669323 .
- ^ Jump up to: а б Капуст, Рэйчел Б.; Тёжер, Йожеф; Коупленд, Терри Д.; Во, Дэвид С. (28 июня 2002 г.). «Специфичность P1' протеазы вируса травления табака». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 294 (5): 949–955. CiteSeerX 10.1.1.375.4271 . дои : 10.1016/S0006-291X(02)00574-0 . ISSN 0006-291X . ПМИД 12074568 .
- ^ Boulware KT, Джабайя А., Догерти П.С. (июнь 2010 г.). «Эволюционная оптимизация пептидных субстратов для протеаз, демонстрирующих быструю кинетику гидролиза». Биотехнология. Биоинж . 106 (3): 339–46. дои : 10.1002/бит.22693 . ПМИД 20148412 . S2CID 205499859 .
- ^ Jump up to: а б Косталлас Г., Лёфдал По, Самуэльсон П. (2011). «Субстратное профилирование протеазы вируса травления табака с использованием нового полноклеточного анализа с помощью флуоресценции» . ПЛОС ОДИН . 6 (1): e16136. Бибкод : 2011PLoSO...616136K . дои : 10.1371/journal.pone.0016136 . ПМК 3022733 . ПМИД 21267463 .
- ^ Паркс Т.Д., Лейтер К.К., Ховард Э.Д., Джонстон С.А., Догерти В.Г. (февраль 1994 г.). «Высвобождение белков и пептидов из слитых белков с использованием рекомбинантной протеиназы вируса растений». Анальный. Биохим . 216 (2): 413–7. дои : 10.1006/abio.1994.1060 . ПМИД 8179197 .
- ^ Йи Л, Гебхард М.К., Ли Кью, Тафт Дж.М., Георгиу Г., Айверсон Б.Л. (апрель 2013 г.). «Инженерия вариантов протеазы TEV с помощью скрининга секвестрации ER дрожжей (YESS) комбинаторных библиотек» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 110 (18): 7229–34. Бибкод : 2013PNAS..110.7229Y . дои : 10.1073/pnas.1215994110 . ПМЦ 3645551 . ПМИД 23589865 .
- ^ Ренике С., Спадаччини Р., Таксис С. (2013). «Протеаза вируса травления табака с повышенной толерантностью к субстрату в положении P1'» . ПЛОС ОДИН . 8 (6): e67915. Бибкод : 2013PLoSO...867915R . дои : 10.1371/journal.pone.0067915 . ПМК 3691164 . ПМИД 23826349 .
- ^ Верховен К.Д., Альтштадт О.К., Савинов С.Н. (март 2012 г.). «Внутриклеточное обнаружение и эволюция сайт-специфических протеаз с использованием системы генетической селекции». Прил. Биохим. Биотехнология . 166 (5): 1340–54. дои : 10.1007/s12010-011-9522-6 . ПМИД 22270548 . S2CID 36583382 .
- ^ Капуст Р.Б., Тёжер Дж., Фокс Дж.Д., Андерсон Д.Е., Черри С., Коупленд Т.Д., Во Д.С. (декабрь 2001 г.). «Протеаза вируса травления табака: механизм автолиза и рациональный дизайн стабильных мутантов с каталитической способностью дикого типа» . Белок англ . 14 (12): 993–1000. дои : 10.1093/протеин/14.12.993 . ПМИД 11809930 .
- ^ Раран-Курусси С., Тёжер Дж., Черри С., Тропеа Дж.Э., Во Д.С. (15 мая 2013 г.). «Дифференциальная температурная зависимость протеаз вируса травления табака и риновируса 3C» . Аналитическая биохимия . 436 (2): 142–144. дои : 10.1016/j.ab.2013.01.031 . ПМК 4196241 . ПМИД 23395976 .
- ^ Налламсетти С., Капуст Р.Б., Тёжер Дж., Черри С., Тропеа Дж.Э., Коупленд Т.Д., Во Д.С. (ноябрь 2004 г.). «Эффективная сайт-специфическая обработка слитых белков протеазой вируса пятнистости вен табака in vivo и in vitro ». Экспр. белка Пуриф . 38 (1): 108–115. дои : 10.1016/j.pep.2004.08.016 . ПМИД 15477088 .
- ^ Кабрита Л.Д., Гилис Д., Робертсон А.Л., Дехук Ю., Руман М., Боттомли С.П. (2007). «Повышение стабильности и растворимости протеазы TEV с использованием дизайна in silico» . Белковая наука . 16 (11): 2360–7. дои : 10.1110/ps.072822507 . ПМК 2211701 . ПМИД 17905838 .
- ^ Корренти С.Э., Геве М.М., Мехлин С., Бандаранаяке А.Д., Джонсен В.А., Руперт П.Б., Брусняк М.Ю., Кларк М., Берк С.Э., Де Ван Дер Шурен В., Пилат К., Тернбо С.М., Мэй Д., Уотсон А., Чан М.К., Бахл С.Д. , Олсон Дж. М., Стронг РК (2018). «Скрининг, крупномасштабное производство и структурная классификация цистинплотных пептидов» . Nat Struct Мол Биол . 25 (3): 270–278. дои : 10.1038/s41594-018-0033-9 . ПМК 5840021 . ПМИД 29483648 .
- ^ Кибл А.Х., Турки П., Стоукс С., Хайрил Ануар И.Н., Рахикайнен Р., Хитонен В.П., Ховарт М. (декабрь 2019 г.). «Достижение бесконечного сродства посредством разработки взаимодействия пептид-белок» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 116 (52): 26523–26533. Бибкод : 2019PNAS..11626523K . дои : 10.1073/pnas.1909653116 . ПМК 6936558 . ПМИД 31822621 .
