РНКаза H-зависимая ПЦР

РНКаза H-зависимая ПЦР (рчПЦР) ^[1] представляет собой модификацию стандартной методики ПЦР . В рчПЦР праймеры имеют съемный блок амплификации на 3'-конце. Амплификация заблокированного праймера зависит от активности расщепления гипертермофильного фермента РНКазы типа II H архей во время гибридизации с комплементарной целевой последовательностью. Этот фермент РНКаза H обладает несколькими полезными характеристиками, улучшающими ПЦР. Во-первых, он обладает очень низкой ферментативной активностью при низкой температуре, что позволяет проводить ПЦР с «горячим стартом » без модификаций ДНК-полимеразы . Во-вторых, эффективность расщепления фермента снижается при наличии несовпадений вблизи остатка РНК. Это позволяет уменьшить образование димеров праймера , ^[1] обнаружение альтернативных вариантов сплайсинга , ^[2]^[3] способность выполнять мультиплексную ПЦР с большим количеством праймеров для ПЦР и способность обнаруживать однонуклеотидные полиморфизмы . ^[4]

Принцип

для рчПЦР Праймеры состоят из трех секций. 1) 5'-участок ДНК, эквивалентный по длине и требованиям к температуре плавления (Tm) стандартному праймеру для ПЦР, удлиняется после расщепления ферментом РНКазой HII. 2) Одно основание РНК обеспечивает сайт расщепления для РНКазы HII. 3) Короткое 3'-удлинение четырех или пяти оснований, за которым следует блокатор (обычно короткая, неудлиняемая молекула, такая как пропандиол ), предотвращает удлинение ДНК-полимеразой до момента удаления. Реакция рчПЦР начинается с отсутствия праймеров и матрицы в растворе (рис. 1). Будучи свободными в растворе, эти праймеры не деблокируются ферментом РНКазой HII, поскольку они должны находиться в гетеродуплексе РНК:ДНК с расщепляемой матрицей. После связывания с матрицей праймеры для рчПЦР расщепляются термостабильным ферментом РНКазой HII. Это удаляет блок, позволяя ДНК-полимеразе выйти за пределы праймеров. Повторение реакции ПЦР продолжает этот процесс. Праймеры для rhPCR сконструированы таким образом, что после расщепления ферментом РНКазой H2 Tm праймеров все еще превышает температуру отжига реакции ПЦР. Эти праймеры можно использовать как для 5'-нуклеазы, так и для 5'-нуклеазы. Taqman и SYBR Green Типы количественной ПЦР .

Приложения

rhPCR может использоваться для количественной ПЦР в медицинских или экологических лабораториях:

См. также

Ссылки

^ Jump up to: ^а ^б Добоси-младший, Роуз С.Д., Бельц К.Р., Рупп С.М., Пауэрс К.М., Белке М.А., Уолдер Дж.А. (август 2011 г.). «РНКаза H-зависимая ПЦР (рчПЦР): улучшенная специфичность и обнаружение полиморфизма отдельных нуклеотидов с использованием блокированных расщепляемых праймеров» . БМК Биотехнология . 11:80 . дои : 10.1186/1472-6750-11-80 . ПМЦ 3224242 . ПМИД 21831278 .
^ Гордон, Эрин Д.; Симпсон, Лаура Дж.; Риос, Сидни Л.; Рингель, Ландо; Лахович-Скроггинс, Марра Э.; Питерс, Майкл С.; Весоловска-Андерсен, Агата; Гонсалес, Жанмари Р.; Маклауд, Ханна Дж.; Кристиан, Лаура С.; Юань, Шаопэн; Барри, Лиам; Вудрафф, Прескотт Г.; Ансель, К. Марк; Нока, Карл; Зейболд, Макс А.; Фэхи, Джон В. (2 августа 2016 г.). «Альтернативный сплайсинг интерлейкина-33 и воспаление 2 типа при астме» . Труды Национальной академии наук . 113 (31): 8765–8770. Бибкод : 2016PNAS..113.8765G . дои : 10.1073/pnas.1601914113 . ПМЦ 4978244 . ПМИД 27432971 .
^ Букар, Энтони А.; Максейнер, Стефан; Зюдхоф, Томас К. (3 января 2014 г.). «Латрофилины функционируют как гетерофильные молекулы клеточной адгезии путем связывания с теневринами. РЕГУЛИРОВАНИЕ ПУТЕМ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА» . Журнал биологической химии . 289 (1): 387–402. дои : 10.1074/jbc.M113.504779 . ПМЦ 3879561 . ПМИД 24273166 .
^ Кахун, А.; Наусс, Джон; Стэнли, Коннер; Куреши, Али (20 февраля 2017 г.). «Глубокое секвенирование транскриптома двух зеленых водорослей, Chara vulgaris и Chlamydomonas Reinhardtii, не дает никаких доказательств редактирования органеллярной РНК» . Гены . 8 (2): 80. doi : 10.3390/genes8020080 . ПМЦ 5333069 . ПМИД 28230734 .

[dobosy_2011-1] Jump up to: ^а ^б Добоси-младший, Роуз С.Д., Бельц К.Р., Рупп С.М., Пауэрс К.М., Белке М.А., Уолдер Дж.А. (август 2011 г.). «РНКаза H-зависимая ПЦР (рчПЦР): улучшенная специфичность и обнаружение полиморфизма отдельных нуклеотидов с использованием блокированных расщепляемых праймеров» . БМК Биотехнология . 11:80 . дои : 10.1186/1472-6750-11-80 . ПМЦ 3224242 . ПМИД 21831278 .

[2] Гордон, Эрин Д.; Симпсон, Лаура Дж.; Риос, Сидни Л.; Рингель, Ландо; Лахович-Скроггинс, Марра Э.; Питерс, Майкл С.; Весоловска-Андерсен, Агата; Гонсалес, Жанмари Р.; Маклауд, Ханна Дж.; Кристиан, Лаура С.; Юань, Шаопэн; Барри, Лиам; Вудрафф, Прескотт Г.; Ансель, К. Марк; Нока, Карл; Зейболд, Макс А.; Фэхи, Джон В. (2 августа 2016 г.). «Альтернативный сплайсинг интерлейкина-33 и воспаление 2 типа при астме» . Труды Национальной академии наук . 113 (31): 8765–8770. Бибкод : 2016PNAS..113.8765G . дои : 10.1073/pnas.1601914113 . ПМЦ 4978244 . ПМИД 27432971 .

[3] Букар, Энтони А.; Максейнер, Стефан; Зюдхоф, Томас К. (3 января 2014 г.). «Латрофилины функционируют как гетерофильные молекулы клеточной адгезии путем связывания с теневринами. РЕГУЛИРОВАНИЕ ПУТЕМ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА» . Журнал биологической химии . 289 (1): 387–402. дои : 10.1074/jbc.M113.504779 . ПМЦ 3879561 . ПМИД 24273166 .

[4] Кахун, А.; Наусс, Джон; Стэнли, Коннер; Куреши, Али (20 февраля 2017 г.). «Глубокое секвенирование транскриптома двух зеленых водорослей, Chara vulgaris и Chlamydomonas Reinhardtii, не дает никаких доказательств редактирования органеллярной РНК» . Гены . 8 (2): 80. doi : 10.3390/genes8020080 . ПМЦ 5333069 . ПМИД 28230734 .

[1]

[2]

[3]

[4]