Хроматография при обработке крови

Хроматография — это физический метод разделения, при котором компоненты, которые необходимо разделить, распределяются между двумя фазами: одна неподвижная (неподвижная фаза), а другая (подвижная фаза), движущаяся в определенном направлении. Холодное осаждение этанолом, разработанное Коном в 1946 году, позволяет манипулировать pH, ионной силой, концентрацией этанола и температурой для осаждения различных фракций белка из плазмы. Хроматографические методы используют ионный обмен, гель-фильтрацию и аффинные смолы для разделения белков. С 1980-х годов он стал эффективным методом очистки компонентов крови для терапевтического использования.

Плазма крови человека

Плазма крови — жидкий компонент крови, содержащий растворенные белки, питательные вещества, ионы и другие растворимые компоненты. В цельной крови эритроциты , лейкоциты и тромбоциты находятся во взвешенном состоянии в плазме. Целью очистки и обработки плазмы является извлечение определенных материалов, присутствующих в крови, и использование их для восстановления и восстановления. В состав плазмы крови входит несколько компонентов, одним из которых является белок альбумин . Альбумин представляет собой хорошо растворимый в воде белок со значительной структурной стабильностью. Он служит транспортным средством для таких материалов, как гормоны, ферменты, жирные кислоты, ионы металлов и лекарственные средства. Он также используется в терапевтических целях, поскольку он необходим для восстановления и поддержания объема циркулирующей крови в чрезвычайных ситуациях, таких как тяжелая травма или хирургическое вмешательство. Поскольку права на ошибку практически нет, необходимо иметь под рукой в ​​достаточном количестве чрезвычайно чистые образцы, не содержащие примесей. Плазма крови человека важна для организма, поскольку позволяет сохранять питательные вещества и т. д.

Развитие хроматографии

Традиционно процесс Кона, для очистки альбумина использовался включающий фракционирование холодным этанолом. Однако хроматографические методы разделения начали внедряться в начале 1980-х годов. Разработки продолжались в период между началом использования фракционирования Кона в 1946 году и началом использования хроматографии в 1983 году. В 1962 году был создан процесс Кистлера и Нишмана, который был побочным продуктом процесса Кона. Хроматографические процессы начали формироваться в 1983 году. В 1990-х годах были созданы процессы Zenalb и CSL Albumex, которые включали хроматографию с некоторыми вариациями.

Общий подход к использованию хроматографии для фракционирования плазмы на альбумин заключается в следующем: выделение супернатанта I, делипидирование, анионообменная хроматография , катионообменная хроматография и гель-фильтрационная хроматография.

Извлеченный очищенный материал смешивают с комбинациями октаноата натрия и N-ацетилтриптофаната натрия, а затем подвергают процедурам вирусной инактивации, включая пастеризацию при 60 °C.

Это более эффективная альтернатива, чем процесс Кона, по четырем основным причинам: 1)нужна была плавная автоматизация и сравнительно недорогой завод, 2) легче стерилизовать оборудование и поддерживать хорошую производственную среду, 3) хроматографические процессы менее повреждают белок альбумин, и 4) можно достичь более успешного конечного результата по альбумину.

По сравнению с процессом Кона чистота альбумина при использовании хроматографии повысилась примерно с 95% до 98%, а выход увеличился примерно с 65% до 85%. Небольшое процентное увеличение имеет значение в отношении таких чувствительных измерений, как чистота. У хроматографии есть один большой недостаток, связанный с экономикой процесса. Хотя метод оказался эффективным с точки зрения переработки, приобретение необходимого оборудования является большой задачей. Необходима большая техника, и долгое время отсутствие оборудования не способствовало его широкому использованию. Компоненты сейчас более доступны, но работа над ними все еще продолжается и, возможно, в будущем они будут готовы помочь миру.

Методы моста

Интеграция традиционных и современных методов — полезный способ обработки альбумина.

Существует три основных этапа, которые сочетают фракционирование Кона с хроматографией: 1) факторы I, II и III удаляются посредством фракционирования холодным этанолом, 2) выполняются процедуры быстрого ионного обмена на сефарозе и быстропроточная хроматография на сефарозе, и 3) проводится гель-фильтрация. бегать. В результате получается альбумин с содержанием алюминия на 9 % ниже, а время обработки сокращается почти в два раза.

Хотя было трудно обеспечить широкое распространение методов хроматографической обработки, глобальное расширение находится в стадии разработки. Различные компоненты крови должны быть легко доступны в различных медицинских центрах по всему миру. Институт трансфузиологии в Скопье , Северная Македония, является центром фракционирования плазмы на Балканах. Их модернизированный процесс очистки альбумина состоит из пяти этапов:

1. Исходным материалом является плазма, предварительно обработанная центрифугированием .
2. Проводят цикл гель-фильтрации,
3. ионный обмен на DEAE- сефарозе для связывания альбумина с колонкой,
4. Альбумин элюируют натрий-ацетатным буфером и
5. Финальная полировка с помощью гель-фильтрации.

Конечным результатом является высокочистая и безопасная партия альбумина, которая на 100% апирогенна , стерильна и не содержит активного вируса ВИЧ . Чистота продукта превышает 98%, а содержание белка около 50 г/л.

Нехроматографические методы обработки

Существуют и другие методы плазменной обработки, но они обычно не обеспечивают разрешения или чистоты хроматографических методов. Двухфазную жидкостную экстракцию можно проводить с использованием полиэтиленгликоль (ПЭГ)-фосфат двухфазных водных систем с верхним слоем, богатым ПЭГ, и нижним слоем, богатым фосфатом. Хотя этот метод в некоторой степени полезен для восстановления белка, он не работает для восстановления других компонентов крови. Преимущество мембранного фракционирования заключается в минимальной потере белка и высоком удалении патологических компонентов плазмы. Этот метод включает в себя такие процессы, как термофильтрация и применение пульсирующего потока. В новейшей двухступенчатой ​​мембранной системе используется контур рециркуляции с высоким потоком, который эффективен для удаления холестерина ЛПНП . Это может оказаться полезным для пациентов с закупоркой артерий и другими сердечно-сосудистыми проблемами, связанными с холестерином. Периодическая адсорбция, например, на ионообменной среде, полезна только при работе с небольшими образцами плазмы, обычно объемом 200 мл или меньше. Периодическая адсорбция восстанавливает продукт в большем объеме элюирующего буфера, чем при колоночной хроматографии или фронтальной хроматографии, и полученный более разбавленный продукт требует концентрации, обычно на мембранной системе, что может привести к потере продукта из-за необратимой адсорбции на мембране.

Ссылки

• Матейчук П., Даш CH, Гаскойн EW (декабрь 2000 г.). «Производство раствора человеческого альбумина: постоянно развивающийся коллоид» . Бр Джей Анест . 85 (6): 887–95. дои : 10.1093/бья/85.6.887 . ПМИД   11732525 .
• Мор Х (декабрь 1999 г.). «Производство человеческого альбумина фракционированием плазмы». Анастезиол Интенсивмед Нотфолмед Шмерцтер . 34 (12): 773–5. ПМИД   10665314 .
• Вуйчицкий Ю.М., Цехановска А., Штробль В., Сабалинска С., Фалькенхаген Д. (2000). «Очистка крови мембранным методом – новый метод эффективного удаления холестерина липопротеинов низкой плотности» . Фронт Мед Биол Инж . 10 (2): 131–7. дои : 10.1163/15685570052061982 . ПМИД   10898242 .