Процесс Кона
Процесс Кона , разработанный Эдвином Дж. Коном , представляет собой серию стадий очистки с целью извлечения альбумина из плазмы крови . Этот процесс основан на различной растворимости альбумина и других белков плазмы в зависимости от pH , концентрации этанола , температуры, ионной силы и концентрации белка. [1] [2] Альбумин имеет самую высокую растворимость и самую низкую изоэлектрическую точку среди всех основных белков плазмы. Это делает его конечным продуктом, который подлежит осаждению или отделению от раствора в твердой форме. Альбумин был отличным заменителем человеческой плазмы во время Второй мировой войны. При назначении раненым солдатам или другим пациентам с кровопотерей он помогал увеличить объем крови и приводил к более быстрому выздоровлению. Метод Кона был достаточно щадящим, чтобы изолированный белок альбумин сохранял свою биологическую активность . [3]
Детали процесса
[ редактировать ]Во время операций концентрация этанола изменяется от первоначального нуля до 40%. В ходе фракционирования pH снижается от нейтрального (7) до более кислого (4,8). Температура начинается с комнатной и снижается до −5 градусов Цельсия. Первоначально кровь замерзает. Есть пять основных фракций. Каждая фракция заканчивается определенным осадком. Эти осадки представляют собой отдельные фракции. [4]
Фракции I, II и III выпадают в осадок на более ранних стадиях. Условия более ранних стадий: 8% этанол, pH 7,2, -3 °C и 5,1% белка для фракции I; 25% этанол, pH 6,9, -5 °C и 3% белка. Альбумин остается во фракции надосадочной жидкости во время разделения твердой и жидкой фаз в этих условиях. Фракция IV содержит несколько нежелательных белков, которые необходимо удалить. Для этого меняют условия, чтобы осадить белки. Условиями для осаждения этих белков являются повышение концентрации этанола с 18 до 40% и повышение pH с 5,2 до 5,8. Наконец, альбумин находится во фракции V. Осаждение альбумина осуществляется путем снижения pH до 4,8, что близко к pI белка, и поддержания концентрации этанола на уровне 40% при концентрации белка 1%. Таким образом, в пятой фракции остается только 1% исходной плазмы. [4]
Однако альбумин теряется на каждой стадии процесса, при этом примерно 20% альбумина теряется на стадиях осаждения перед фракцией V. Для очистки альбумина проводится экстракция водой и доведение до 10% этанола, pH 4,5 при −3 °С. Любой осадок, образующийся здесь, образуется в результате фильтрации и является примесью. Эти осадки выбрасывают. Переосаждение или повторение этапа осаждения для повышения чистоты осуществляется путем повышения концентрации этанола до 40% со стадии экстракции. pH составляет 5,2, анализ проводится при -5 °C. Было создано несколько вариантов фракции Кона для обеспечения более низкой стоимости и более высокого выхода. Обычно, если выход высокий, чистота снижается примерно до 85–90%. [4]
| Фракция №: | Фракция I | Фракция II | Фракция III | Фракция IV | Фракция V |
|---|---|---|---|---|---|
| Этанол %: | 8 | 25 | 18 | 40 | 40 |
| рН: | 7.2 | 6.9 | 5.2 | 5.8 | 4.8 |
| Температура (°С) | −3 | −5 | −5 | −5 | −5 |
| Белковая фракция (%): | 5.1 | 3 | 3 | 3 | 1 |
Продукты, кроме альбумина
[ редактировать ]Кон смог открыть лабораторию фракционирования плазмы после того, как получил огромное финансирование от государственных учреждений и частных фармацевтических компаний. Это привело к фракционированию плазмы человека. Оказалось, что человеческая плазма содержит несколько полезных компонентов, помимо альбумина. человека Фракционирование плазмы крови позволило получить сывороточный альбумин человека , сывороточный гамма- глобулин , фибриноген , тромбин и глобулины группы крови. [5] Фракции фибриногена и тромбина в дальнейшем были объединены во время войны в дополнительные продукты, в том числе жидкий фибриновый герметик , [6] твердая пена фибрина и пленка фибрина. [7] Гамма-глобулины содержатся во фракциях II и III и оказались незаменимыми при лечении кори у солдат. Гамма-глобулин также был полезен при лечении полиомиелита, но не оказал большого эффекта при лечении эпидемического паротита или скарлатины. Самое главное, что гамма-глобулины были полезны для модификации и предотвращения инфекционного гепатита во время Второй мировой войны. В конечном итоге это стало средством лечения детей, заразившихся этим типом гепатита. [5]
Жидкий фибриновый герметик использовался при лечении жертв ожогов, в том числе после нападения на Перл-Харбор, для прикрепления кожных трансплантатов с повышенным уровнем успеха. [6] Он также оказался полезным при повторном соединении или анастомозировании разорванных нервов. [6] Пена фибрина и тромбин использовались для контроля кровотечения из кровеносных сосудов, особенно при повреждениях печени и вблизи опухолей. Это также свело к минимуму кровотечение из крупных вен, а также помогло справиться с пороками развития кровеносных сосудов головного мозга. Фибриновая пленка использовалась для остановки кровотечения в различных хирургических операциях, включая нейрохирургию. [6] Однако это не помогло остановить артериальное кровотечение. [5] Первым продуктом на основе фибриногена/фибрина, способным остановить артериальное кровотечение, была «фибриновая герметизирующая повязка» или «кровоостанавливающая повязка (HD)», изобретенная Мартином Макфи в Американском Красном Кресте в начале 1990-х годов и испытанная в сотрудничестве с армией США. [8] [9]
Варианты процесса
[ редактировать ]Метод Герлофа, разработанный в 1955 году, улучшил экономику процесса за счет снижения потребления этанола. Вместо 40% на некоторых этапах Герлоф использовал для осаждения 20% этанола. Это особенно используется для фракций II и III. Кроме того, Герлоф объединил две фракции с помощью IV в один этап, чтобы уменьшить количество необходимых фракционирований. Хотя этот метод оказался менее дорогим, он не был принят промышленностью из-за такого сочетания фракций II, III и IV из-за опасений смешивания и высокого содержания примесей. [10]
Метод Хинка был разработан в 1957 году. Этот метод дал более высокие выходы за счет восстановления некоторых белков плазмы, отброшенных во фракциях IV. Однако улучшенные выходы уравновешиваются полученной более низкой чистотой в пределах 85%. [10]
Метод Малфорда, аналогичный методу Хинка, использовал супернатант фракций II и III в качестве последнего этапа перед окончательной отделкой и термообработкой. Метод объединил фракции IV и V, но в этом случае альбумин не будет таким чистым, хотя выходы могут быть выше. [10]
Другой вариант был разработан Кистлером и Нитшманном, чтобы обеспечить более чистую форму альбумина, хотя это и компенсировалось меньшим выходом. Подобно Герлоху, осадок А, который эквивалентен фракциям Кона II и III, был получен при более низкой концентрации этанола - 19%, но pH в этом случае также был ниже - до 5,85. Также аналогично Герлоу и Малфорду, фракция IV была объединена и осаждена в условиях 40% этанола, pH 5,85 и температуры -8 градусов C. Альбумин, который выделяют во фракции V, выделяют в осадке C при температуре Доведение pH до 4,8. Подобно процессу Кона, альбумин очищается путем экстракции в воду с последующим осаждением примесей при 10% этаноле, pH 4,6 и -3 градусах Цельсия. Как и в процессе Кона, образовавшийся здесь осадок отфильтровывают и выбрасывают. Затем осадок С (фракция V) переосаждают при рН 5,2 и хранят в виде пасты при -40 градусах С. [10] Этот процесс получил более широкое признание, поскольку он разделяет фракции и делает каждую стадию независимой друг от друга.
| Осадок: | А | Б | С |
|---|---|---|---|
| Этанол %: | 19 | 40 | 40 |
| рН: | 5.85 | 5.85 | 4.8 |
| Температура (градусы Цельсия) | −3 | −8 | −8 |
Другой вариант включал фракционирование этанола при нагревании. Первоначально он был разработан для инактивации вируса гепатита. В этом процессе наиболее важной целью является получение высокочистого альбумина с высоким выходом, в то время как другие белки плазмы игнорируются. Чтобы альбумин не денатурировал при нагревании, существуют стабилизаторы, такие как октаноат натрия, которые позволяют альбумину выдерживать более высокие температуры в течение длительного времени. В нагретом этаноле плазму подвергают термообработке при 68 градусах С октаноатом натрия с 9% этанолом при рН 6,5. Это приводит к улучшению извлечения альбумина с выходом 90% и чистотой 100%. Это не так дорого, как процедуры с использованием холодного этанола, такие как процесс Кона. Одним из недостатков является присутствие новых антигенов из-за возможной тепловой денатурации альбумина. Кроме того, другие белки плазмы имеют практическое применение, и пренебрегать ими не стоит. Наконец, дорогие емкости для термообработки компенсируют более низкую стоимость по сравнению с форматом холодного этанола, который в этом не нуждается. По этим причинам некоторые компании не приняли на вооружение этот метод, хотя он дает наиболее впечатляющие результаты. Однако одной из известных организаций, которая его использует, является Красный Крест Германии. [10]
Последний вариант был разработан Хао в 1979 году. Этот метод значительно упрощен по сравнению с процессом Кона. Его цель — добиться высоких выходов альбумина, пока альбумин является единственным продуктом. В ходе двухстадийного процесса примеси осаждаются непосредственно из надосадочной жидкости фракций II и III при 42% этаноле, pH 5,8, температуре -5 градусов C, 1,2% белка и ионной силе 0,09. Фракция V осаждается при pH 4,8. Фракции I, II, III и IV соосаждают в 40%-ном этаноле при рН от 5,4 до 7,0 и температуре от -3 до -7 градусов С. Затем фракцию V осаждают при рН 4,8 и -10 градусов С. Высокие выходы. обусловлены сочетанием упрощенного процесса с меньшими потерями на соосаждение и применением фильтрации. Более высокая чистота также была достигнута при 98% из-за более высоких уровней этанола, но выходы были снижены при высокой чистоте. [10]
Более поздние методы включают использование хроматографии . [11]
Влияние процесса Кона
[ редактировать ]Процесс Кона стал крупным достижением в области фракционирования крови. Он имеет несколько практических применений при лечении таких заболеваний, как гепатит и полиомиелит. Это было наиболее полезно во время Второй мировой войны, когда солдаты выздоравливали быстрее из-за переливания альбумина. Как показано выше, процесс Кона с годами менялся. Кроме того, это повлияло на другие процессы в отрасли фракционирования крови. Это привело к появлению новых форм фракционирования, таких как хроматографическое фракционирование плазмы в процессах ионного обмена и отделки альбумина. В целом, процесс Кона и его варианты дали огромный импульс и по сей день служат основой для индустрии фракционирования. [12]
Однако этот процесс недостаточно изучен из-за своей архаичности. Самое главное, что он ни разу не модернизировался компаниями-производителями. Формат холодного этанола может быть слишком мягким, чтобы уничтожить некоторые вирусы, требующие тепловой инактивации. Поскольку этот процесс остается неизменным в течение столь долгого времени, некоторые встроенные неэффективности и несоответствия влияют на экономику процесса для фармацевтических и производственных компаний. [12] Единственным исключением из этого правила было применение в Шотландии непрерывной обработки вместо пакетной обработки. Этот процесс был разработан в Центре фракционирования белков (PFC), учреждении фракционирования плазмы Шотландской национальной службы переливания крови (SNBTS). Этот процесс включал поточный мониторинг и контроль pH и температуры, а также управление потоками плазмы и этанола с помощью прецизионных шестеренчатых насосов, и все это под компьютеризированным контролем с обратной связью. В результате фракции Кона I+II+III, IV и V были получены за несколько часов, а не за многие дни. Непрерывное приготовление криопреципитата впоследствии было интегрировано в процесс, предшествующий фракционированию по Кону. [13]
Тем не менее, этот процесс по-прежнему служит основой для индустрии крови в целом, и его влияние можно увидеть при разработке новых методов. Несмотря на то, что процесс Кона имеет свои недостатки в зависимости от варианта, основным преимуществом процесса Кона является его практическое использование и полезность в фармакологической и медицинской промышленности. [ нужна ссылка ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Фостер, Питер (1994). Энциклопедия химической технологии Кирка-Отмера, 4-е издание, том 11, 990-1021 . стр. 990–1021.
- ^ Кон, Э.Дж.; Стронг, LE; Хьюз, WL; Малфорд, диджей; Эшворт, Дж. Н.; Мелин, М.; Тейлор, HL (1946). «Получение и свойства белков сыворотки и плазмы. IV. Система разделения на фракции белковых и липопротеиновых компонентов биологических тканей и жидкостей1a,b,c,d». Журнал Американского химического общества . 68 (3): 459–475. дои : 10.1021/ja01207a034 . ISSN 0002-7863 . ПМИД 21015743 .
- ^ Сургенор, Дуглас. Эдвин Дж. Кон и развитие химии белков. Центр исследований крови.
- ^ Jump up to: а б с Харрис, Джеймс Р. Разделение крови и фракционирование плазмы. Вили-Лисс. 1991 год
- ^ Jump up to: а б с Бирни, Г.Д. Субклеточные компоненты: получение и фракционирование. Баттерворт. 1972.
- ^ Jump up to: а б с д Кон, Э.Дж. История фракционирования плазмы. В книге «Достижения военной медицины» Андрус и др. Ред. Литтл, Браун и компания, 1948 г.,
- ^ Макфи, MJ и др. Тканевые герметики доступны сегодня. В тканевых клеях в косметической хирургии, ред. Saltz & Toriumi, Quality Medical Publishing, 2004.
- ^ Холкомб Дж.Б., Пусатери А.Е., Хесс Дж.Р., Хетц С.П., Харрис Р.А., Ток Б.Б., Дрохан В.Н., Макфи М.Дж. (август 1997 г.). «Применение новой технологии сухого фибринового герметика для травматологической хирургии». Хирург. Клин. Северный Ам . 77 (4): 943–52. дои : 10.1016/s0039-6109(05)70596-x . ПМИД 9291993 .
- ^ Трэвис, Дж. Создание лучших бинтов. Science News Online, том 155, № 25, 19 июня 1999 г. Доступно в Интернете по адресу http://www.sciencenews.org/sn_arc99/6_19_99/bob2.htm.
- ^ Jump up to: а б с д и ж Грэм Дж. М., Риквуд Д. Субклеточное фракционирование: практический подход. Издательство Оксфордского университета. 1997.
- ^ Танака, К.; Сигеока, EM; Саватани, Э.; Диас, Джорджия; Араширо, Ф.; Кампос, TCXB; Накао, ХК (1998). «Очистка человеческого альбумина сочетанием метода Кона с жидкостной хроматографией» . Бразильский журнал медицинских и биологических исследований . 31 (11): 1383–1388. дои : 10.1590/S0100-879X1998001100003 . ISSN 1678-4510 . ПМИД 9921272 .
- ^ Jump up to: а б Петц, Л.Д., Свишер С. Клиническая практика трансфузионной медицины. Черчилль-Ливингстон. 1989.
- ^ Фостер PR (февраль 2016 г.). «Производство продуктов плазмы крови в Шотландии: краткая история». Скотт Мед Дж . 61 (1): 34–41. дои : 10.1177/0036933015619311 . ПМИД 26610795 . S2CID 32757477 .