Нативное химическое лигирование
Нативное химическое лигирование (NCL) является важным расширением концепции химического лигирования для построения более крупной полипептидной цепи путем ковалентной конденсации двух или более незащищенных пептидных сегментов. [1] Нативное химическое лигирование является наиболее эффективным методом синтеза нативных или модифицированных белков типичного размера ( белков т.е. < ~300 АК). [2]
Реакция
[ редактировать ]При нативном химическом лигировании ионизированная тиоловая группа N-концевого цистеинового остатка незащищенного пептида атакует С-концевой тиоэфир второго незащищенного пептида в водном буфере при pH 7,0 и комнатной температуре. Эта стадия транстиоэтерификации обратима в присутствии арилтиолового катализатора, что делает реакцию как хемоселективной, так и региоселективной, и приводит к образованию промежуточного соединения, связанного с тиоэфирной связью. Промежуточное соединение быстро и спонтанно перестраивается за счет внутримолекулярного S,N- ацильного сдвига , что приводит к образованию нативной амидной (« пептидной ») связи в месте лигирования (схема 1).
Примечания:
- Тиоловые добавки:
Начальная стадия транстиоэтерификации нативной реакции химического лигирования катализируется тиоловыми добавками. Наиболее эффективным и широко используемым тиоловым катализатором является 4-меркаптофенилуксусная кислота (МПАА) (ссылка).
Ключевой особенностью нативного химического лигирования незащищенных пептидов является обратимость первого этапа — реакции тиол(ат)-тиоэфирного обмена. Нативное химическое лигирование является исключительно региоселективным, поскольку стадия тиол(ат)-тиоэфирного обмена свободно обратима в присутствии добавленного арилтиолового катализатора. Полученные высокие выходы конечного продукта лигирования, даже в присутствии внутренних остатков Cys в одном/обаих сегментах, являются результатом необратимости второй (ацильный сдвиг S-к-N) стадии образования амида в используемых условиях реакции. .
- Хемоселективность NCL:
Никакие побочные продукты не образуются в результате реакции с другими функциональными группами, присутствующими в любом пептидном сегменте (например, Asp, карбоновые кислоты боковой цепи Glu; аминогруппа Lys-эпсилон; фенольный гидроксил Tyr; гидроксилы Ser, Thr и т. д.).
Исторический контекст
[ редактировать ]В 1992 году Стивен Кент и Мартина Шнёльцер из Научно-исследовательского института Скриппса разработали концепцию «Химического лигирования», первого практического метода ковалентной конденсации незащищенных пептидных сегментов; ключевой особенностью химического лигирования является образование неестественной связи в месте лигирования. Всего два года спустя, в 1994 году, Филип Доусон, Том Мьюир и Стивен Кент сообщили о «Нативном химическом лигировании», расширении концепции химического лигирования до образования нативной амидной («пептидной») связи после начальной нуклеофильной конденсации с образованием тиоэфирной связи. связанный продукт конденсации, предназначенный для спонтанной перегруппировки в нативную амидную связь в месте лигирования.
Теодор Виланд и его коллеги сообщили о ацильном сдвиге S-на-N еще в 1953 году, когда было показано, что реакция тиоэфира валина и цистеина в водном буфере приводит к образованию дипептида валин-цистеина. аминокислоты [3] Реакция протекала через посредство тиоэфира, содержащего серу цистеинового остатка. Однако работа Виланда НЕ привела к развитию собственной реакции химического лигирования. Скорее, изучение реакций тиоэфиров аминокислот привело Виланда и других к разработке метода «активного эфира» для синтеза защищенных пептидных сегментов обычными химическими методами, выполняемыми в органических растворителях.
Функции
[ редактировать ]Нативное химическое лигирование составляет основу современного химического синтеза белков и используется для получения многочисленных белков и ферментов путем полного химического синтеза. Преимущество нативного метода химического лигирования заключается в том, что связывание длинных пептидов с помощью этого метода обычно является почти количественным и обеспечивает синтетический доступ к крупным пептидам и белкам, которые иначе невозможно из-за их большого размера сделать декорированными посттрансляционной модификацией и не содержат -кодированная аминокислота или другие химические строительные блоки.
Нативное химическое лигирование по своей сути является «зеленым» благодаря своей атомной экономике и использованию безопасных растворителей. Он включает реакцию незащищенного тиоэфира пептида со вторым незащищенным пептидом, имеющим N-концевой остаток цистеина. Его проводят в водном растворе при нейтральном pH, обычно в 6 М гидрохлориде гуанидина, в присутствии арилтиолового катализатора и обычно дают почти количественные выходы желаемого продукта лигирования.
Пептид-тиоэфиры могут быть получены непосредственно с помощью Boc-химии SPPS ; однако тиоэфирсодержащие пептиды не стабильны при обработке нуклеофильным основанием, что предотвращает прямой синтез пептидных тиоэфиров с помощью Fmoc-химии SPPS . Методы твердофазного пептидного синтеза Fmoc-химии для получения пептид-тиоэфиров основаны на синтезе пептидных гидразидов, которые постсинтетически превращаются в пептидные тиоэфиры.
Полипептидные С-концевые тиоэфиры также можно получать in situ , используя так называемые системы N,S -ацильного сдвига. К этому семейству принадлежит бис (2-сульфанилэтил)амидогруппа, также называемая группой SEA. (2-сульфанилэтил)амиды полипептида С-концевые бис- (пептидные сегменты SEA) реагируют с пептидом Cys, образуя нативную пептидную связь, как в NCL. Эта реакция, которая называется лигированием нативного пептида SEA , является полезным вариантом нативного химического лигирования. [4]
При создании пептидных сегментов, содержащих N-концевой остаток цистеина, следует избегать воздействия кетонов, поскольку они могут блокировать N-концевой цистеин. Не используйте защитные группы, выделяющие альдегиды или кетоны . использования ацетона По той же причине следует избегать , особенно при мытье стеклянной посуды, используемой для лиофилизации .
Особенностью нативного метода химического лигирования является то, что полипептидная цепь продукта содержит цистеин в месте лигирования. Цистеин в месте лигирования может быть десульфурирован до аланина , тем самым расширяя диапазон возможных сайтов лигирования за счет остатков аланина. Другие бета-тиолсодержащие аминокислоты можно использовать для нативного химического лигирования с последующей десульфурацией. Альтернативно можно использовать тиолсодержащие вспомогательные вещества для лигирования, которые имитируют N-концевой цистеин для реакции лигирования, но которые можно удалить после синтеза. Использование тиолсодержащих вспомогательных веществ может быть не столь эффективным, как лигирование по остатку Cys. Нативное химическое лигирование также можно выполнить с N-концевым остатком селеноцистеина. [5]
Полипептидные С-концевые тиоэфиры, полученные методами рекомбинантной ДНК, можно вводить в реакцию с N-концевым Cys-содержащим полипептидом с помощью той же нативной химии лигирования с получением очень крупных полусинтетических белков. Нативное химическое лигирование такого типа с использованием сегмента рекомбинантного полипептида известно как лигирование экспрессированного белка. Аналогично, рекомбинантный белок, содержащий N-концевой Cys, может взаимодействовать с тиоэфиром синтетического полипептида . Таким образом, нативное химическое лигирование можно использовать для введения химически синтезированных сегментов в рекомбинантные белки независимо от их размера.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Доусон, ЧП; Мьюир, ТВ; Кларк-Льюис, И.; Кент, С.Б. (1994). «Синтез белков методом нативного химического лигирования». Наука . 266 (5186): 776–778. Бибкод : 1994Sci...266..776D . дои : 10.1126/science.7973629 . ПМИД 7973629 .
- ^ Агуридас В., Эль Махди О., Димер В., Каргоэт М., Монбалиу Ж.М., Мельник О. (июнь 2019 г.). «Нативное химическое лигирование и расширенные методы: механизмы, катализ, область применения и ограничения». Химические обзоры . 119 (12): 7328–7443. doi : 10.1021/acs.chemrev.8b00712 . ПМИД 31050890 . S2CID 145023266 .
- ^ Виланд, Т.; Бокельманн, Э.; Бауэр, Л.; Ланг, Ху; Лау, Х (1953). «О синтезе пептидов. 8-е сообщение. Образование S-содержащих пептидов путем внутримолекулярной миграции аминоацильных остатков». Анна Либиха. Хим . 583 : 129–149. дои : 10.1002/jlac.19535830110 .
- ^ Оливье, Н. Дер, Ж. Мхидиа, Р. Бланпен, А. Мельник, О. (2010). «Лигирование бис(2-сульфанилэтил)амино нативного пептида». Органические буквы 12 (22): 5238–41. дои : 10.1021/ol102273u . ПМИД 20964289 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ МакГрат, Северная Каролина; Рейнс, RT (2011). «Хемоселективность в химической биологии: реакции переноса ацила с серой и селеном» . Акк. хим. Рез . 44 (9): 752–761. дои : 10.1021/ar200081s . ПМЦ 3242736 . ПМИД 21639109 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Мьюир Т.В.; Сондхи Д.; Коул П.А. (1998). «Экспрессированное лигирование белков: общий метод белковой инженерии» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 95 (12): 6705–6710. Бибкод : 1998PNAS...95.6705M . дои : 10.1073/pnas.95.12.6705 . ПМК 22605 . ПМИД 9618476 .
- Нильссон Б.Л.; Зёлльнер МБ; Рейнс РТ (2005). «Химический синтез белков» . Анну. Преподобный Биофиз. Биомол. Структурировать . 34 : 91–118. doi : 10.1146/annurev.biophys.34.040204.144700 . ПМЦ 2845543 . ПМИД 15869385 .
- Кент СБХ (2009). «Тотальный химический синтез белков». Обзоры химического общества . 38 (2): 338–351. дои : 10.1039/B700141J . ПМИД 19169452 . S2CID 5432012 .
- Конибер переменного тока; Уотсон Э.Э.; Пейн Р.Дж.; Беккер CFW (2018). «Нативное химическое лигирование в синтезе и полусинтезе белка». Обзоры химического общества . 47 (24): 9046–9068. дои : 10.1039/c8cs00573g . hdl : 2123/22610 . ПМИД 30418441 .