Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия

Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия ( FCCS ) — это спектроскопический метод, который исследует взаимодействия флуоресцентных частиц разных цветов, когда они случайным образом диффундируют через микроскопический объем обнаружения с течением времени в устойчивых условиях. ^[1]

Открытие

Эйген и Риглер впервые представили метод флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии (FCCS) в 1994 году. Позже, в 1997 году, Швилле экспериментально реализовал этот метод. ^[2]^[3]

Теория

FCCS — это расширение метода корреляционной спектроскопии флуоресценции (FCS), в котором используются две флуоресцентные молекулы вместо одной, излучающей разные цвета. Этот метод измеряет совпадающие флуктуации интенсивности зеленого и красного цвета отдельных молекул, которые коррелируют, если частицы, помеченные зеленым и красным, движутся вместе через заранее определенный конфокальный объем. ^[2] В FCCS используются два вида, которые независимо метятся двумя разными флуоресцентными зондами разного цвета. Эти флуоресцентные зонды возбуждаются и обнаруживаются двумя разными источниками лазерного света и детекторами, обычно обозначаемыми как «зеленый» и «красный». Объединение FCCS с конфокальным микроскопом подчеркивает возможности метода, поскольку становится возможным обнаруживать флуоресцентные молекулы в фемтолитровых объемах в наномолярном диапазоне, с высоким соотношением сигнал/шум и в микросекундном масштабе времени. ^[4]

Нормализованная функция взаимной корреляции определяется для двух видов флуоресценции, G и R, которые являются независимыми зеленым и красным каналами соответственно:

$\ G_{GR}(\tau )=1+{\frac {\langle \delta I_{G}(t)\delta I_{R}(t+\tau )\rangle }{\langle I_{G}(t)\rangle \langle I_{R}(t)\rangle }}={\frac {\langle I_{G}(t)I_{R}(t+\tau )\rangle }{\langle I_{G}(t)\rangle \langle I_{R}(t)\rangle }}$

где дифференциальные флуоресцентные сигналы $\ \delta I_{G}$ в определенное время, $\ t$ и $\ \delta I_{R}$ во время задержки, $\ \tau$ позже коррелируют друг с другом. В отсутствие спектрального просачивания – когда в наблюдаемом канале виден сигнал флуоресценции из соседнего канала – функция взаимной корреляции равна нулю для невзаимодействующих частиц. В отличие от FCS, функция взаимной корреляции возрастает с увеличением числа взаимодействующих частиц.

FCCS в основном используется для изучения биомолекулярных взаимодействий как в живых клетках , так и in vitro. ^[5]^[2] Он позволяет измерять простые молекулярные стехиометрии и константы связывания. ^[3] Это один из немногих методов, который может предоставить информацию о белок-белковых взаимодействиях в определенное время и в определенном месте внутри живой клетки. В отличие от резонансного переноса энергии флуоресценции , FCCS не имеет ограничения по расстоянию для взаимодействий, что делает его пригодным для исследования больших комплексов. Однако FCCS требует активной диффузии комплексов через фокус микроскопа в относительно короткие сроки, обычно секунды.

Моделирование

Математическая функция, используемая для моделирования кривых взаимной корреляции в FCCS, немного более сложна по сравнению с той, которая используется в FCS. Одним из основных отличий является эффективный наложенный объем наблюдения, обозначаемый как $\ V_{eff,RG}$ в котором каналы G и R образуют единый объем наблюдения:

$\ V_{eff,RG}=\pi ^{3/2}(\omega _{xy,G}^{2}+\omega _{xy,R}^{2})(\omega _{z,G}^{2}+\omega _{z,R}^{2})^{1/2}/2^{3/2}$

где $\ \omega _{xy,G}^{2}$ и $\ \omega _{xy,R}^{2}$ – радиальные параметры и $\ \omega _{z,G}$ и $\ \omega _{z,R}$ — осевые параметры для каналов G и R соответственно.

Время диффузии, $\ \tau _{D,GR}$ поэтому для дважды (G и R) флуоресцентных видов описывается следующим образом:

$\ \tau _{D,GR}={\frac {\omega _{xy,G}^{2}+\omega _{xy,R}^{2}}{8D_{GR}}}$

где $\ D_{GR}$ – коэффициент диффузии дважды флуоресцентной частицы.

Кривая взаимной корреляции, полученная в результате диффузии флуоресцентных частиц с двойной меткой, может быть смоделирована в отдельных каналах следующим образом:

$\ G_{G}(\tau )=1+{\frac {(<C_{G}>Diff_{k}(\tau )+<C_{GR}>Diff_{k}(\tau ))}{V_{eff,GR}(<C_{G}>+<C_{GR}>)^{2}}}$

$\ G_{R}(\tau )=1+{\frac {(<C_{R}>Diff_{k}(\tau )+<C_{GR}>Diff_{k}(\tau ))}{V_{eff,GR}(<C_{R}>+<C_{GR}>)^{2}}}$

В идеальном случае функция взаимной корреляции пропорциональна концентрации дважды меченного флуоресцентного комплекса:

$\ G_{GR}(\tau )=1+{\frac {<C_{GR}>Diff_{GR}(\tau )}{V_{eff}(<C_{G}>+<C_{GR}>)(<C_{R}>+<C_{GR}>)}}$

с $\ Diff_{k}(\tau )={\frac {1}{(1+{\frac {\tau }{\tau _{D,i}}})(1+a^{-2}({\frac {\tau }{\tau _{D,i}}})^{1/2}}}$

Амплитуда взаимной корреляции прямо пропорциональна концентрации веществ с двойной меткой (красной и зеленой). ^[4]^[6]

Экспериментальный метод

FCCS измеряет совпадающие колебания интенсивности зеленого и красного цвета отдельных молекул, которые коррелируют, если частицы, помеченные зеленым и красным, движутся вместе через заранее определенный конфокальный объем. Для проведения флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии (FCCS) интересующие образцы сначала помечаются флуоресцентными зондами разных цветов. Установка FCCS обычно включает в себя конфокальный микроскоп, два лазерных источника и два детектора. Конфокальный микроскоп используется для фокусировки лазерных лучей и сбора сигналов флуоресценции. Сигналы от детекторов затем собираются и записываются с течением времени. ^[6]^[7] Анализ данных включает перекрестную корреляцию сигналов для определения степени корреляции между двумя флуоресцентными зондами. Эту информацию можно использовать для извлечения данных о стехиометрии и константах связывания молекулярных комплексов, а также о времени и месте взаимодействий внутри живых клеток. ^[6]

Приложения

Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS) имеет несколько применений в области биофизики и биохимии . Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS) — мощный метод, позволяющий исследовать взаимодействия между различными типами биомолекул , включая белки , нуклеиновые кислоты и липиды . ^[8]

FCCS — один из немногих методов, который может предоставить информацию о белок-белковых взаимодействиях в определенное время и в определенном месте внутри живой клетки. FCCS можно использовать для изучения динамики биомолекул в живых клетках, включая скорость их диффузии и локализацию. ^[9]

Это может дать представление о функциях и регуляции клеточных процессов. В отличие от резонансной передачи энергии Фёрстера , FCCS не имеет ограничения по расстоянию для взаимодействий, что делает его пригодным для исследования больших комплексов. Однако FCCS требует активной диффузии комплексов через фокус микроскопа в относительно короткие сроки, обычно секунды. FCCS позволяет измерять простые молекулярные стехиометрии и константы связывания . ^[9]

См. также

Ссылки

^ Томас Вайдеманн; Петра Швилле (2013). «Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия» . Энциклопедия биофизики . стр. 795–799. дои : 10.1007/978-3-642-16712-6_509 . ISBN 978-3-642-16711-9 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Слотер, BD; Унру, младший; Ли, Р. Флуоресцентная флуктуационная спектроскопия и методы визуализации для изучения динамических белковых взаимодействий в дрожжах. В методах молекулярной биологии: биология дрожжевых систем. Дж. И. Кастрилло и С. Г. Оливер, ред. (Спрингер, Нью-Йорк, 2011 г.). Том. 759, стр. 283-306.
^ Jump up to: ^а ^б Чен Ю. и Мюллер Дж. Д. Определение стехиометрии белковых гетерокомплексов в живых клетках с помощью флуоресцентной флуктуационной спектроскопии. (2006) Учеб. Натл. акад. наук. США 104, 3147-3152.
^ Jump up to: ^а ^б Кирстен Басия; Ирина Владимировна Мажуль; Петра Швилле (август 2002 г.). «Изучение эндоцитарного пути в живых клетках с использованием двухцветного флуоресцентного кросс-корреляционного анализа» (PDF) . Биофизический журнал . 83 (2): 1184–1193. Бибкод : 2002BpJ....83.1184B . дои : 10.1016/S0006-3495(02)75242-9 . ПМК 1302220 . ПМИД 12124298 . Архивировано из оригинала (PDF) 24 сентября 2015 г. Проверено 27 февраля 2015 г.
^ Басия, К.; Ким, Ю.А.; Швилле, П. Флуоресцентная кросскорреляционная спектроскопия в живых клетках. (2006) Нат. Мет. 3, 83-89.
^ Jump up to: ^а ^б ^с Лора Ваврезиник; Эрве Риньо; Дидье Марге; Пьер-Франсуа Ленн (декабрь 2005 г.). «Законы диффузии корреляционной спектроскопии флуоресценции для исследования субмикронной организации клеточных мембран» . Биофизический журнал . 89 (6): 4029–4042. Бибкод : 2005BpJ....89.4029W . дои : 10.1529/biophysj.105.067959 . ПМК 1366968 . ПМИД 16199500 .
^ Мэтью Дж. Лоуренс; Тимоти С. Карпентер; Тед А. Лоуренс; Мэтью А. Коулман; Меган Шелби; Чао Лю (март 2022 г.). «Биофизическая характеристика мембранных белков, встроенных в нанодиски, с использованием корреляционной флуоресцентной спектроскопии» . Мембраны . 12 (4): 392. doi : 10.3390/membranes12040392 . ПМЦ 9028781 . ПМИД 35448362 .
^ Ю Чен; Дж. Д. Мюллер; К.М. Берляндия; Э. Граттон (октябрь 1999 г.). «Спектроскопия флуоресцентных флуктуаций» . Методы . 19 (2): 234–52. дои : 10.1006/meth.1999.0854 . ПМИД 10527729 . S2CID 5609799 .
^ Jump up to: ^а ^б Кирстен Басия; Эльке Хаустейн; Петра Швилле (июль 2014 г.). «Флуоресцентная корреляционная спектроскопия: принципы и приложения». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2014 (7): 709–25. дои : 10.1101/pdb.top081802 . ПМИД 24987147 .

Внешние ссылки

Кросс-корреляция флуоресценции (FCCS) (Becker & Hickl GmbH, веб-страница)

[1] Томас Вайдеманн; Петра Швилле (2013). «Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия» . Энциклопедия биофизики . стр. 795–799. дои : 10.1007/978-3-642-16712-6_509 . ISBN 978-3-642-16711-9 .

[Slaughter_Unruh_2011-2] Jump up to: ^а ^б ^с Слотер, BD; Унру, младший; Ли, Р. Флуоресцентная флуктуационная спектроскопия и методы визуализации для изучения динамических белковых взаимодействий в дрожжах. В методах молекулярной биологии: биология дрожжевых систем. Дж. И. Кастрилло и С. Г. Оливер, ред. (Спрингер, Нью-Йорк, 2011 г.). Том. 759, стр. 283-306.

[Chen_Mueller_2006-3] Jump up to: ^а ^б Чен Ю. и Мюллер Дж. Д. Определение стехиометрии белковых гетерокомплексов в живых клетках с помощью флуоресцентной флуктуационной спектроскопии. (2006) Учеб. Натл. акад. наук. США 104, 3147-3152.

[Bacia_Majoul_Schwille_2002-4] Jump up to: ^а ^б Кирстен Басия; Ирина Владимировна Мажуль; Петра Швилле (август 2002 г.). «Изучение эндоцитарного пути в живых клетках с использованием двухцветного флуоресцентного кросс-корреляционного анализа» (PDF) . Биофизический журнал . 83 (2): 1184–1193. Бибкод : 2002BpJ....83.1184B . дои : 10.1016/S0006-3495(02)75242-9 . ПМК 1302220 . ПМИД 12124298 . Архивировано из оригинала (PDF) 24 сентября 2015 г. Проверено 27 февраля 2015 г.

[5] Басия, К.; Ким, Ю.А.; Швилле, П. Флуоресцентная кросскорреляционная спектроскопия в живых клетках. (2006) Нат. Мет. 3, 83-89.

[Wawrezinieck_et_al_2005-6] Jump up to: ^а ^б ^с Лора Ваврезиник; Эрве Риньо; Дидье Марге; Пьер-Франсуа Ленн (декабрь 2005 г.). «Законы диффузии корреляционной спектроскопии флуоресценции для исследования субмикронной организации клеточных мембран» . Биофизический журнал . 89 (6): 4029–4042. Бибкод : 2005BpJ....89.4029W . дои : 10.1529/biophysj.105.067959 . ПМК 1366968 . ПМИД 16199500 .

[7] Мэтью Дж. Лоуренс; Тимоти С. Карпентер; Тед А. Лоуренс; Мэтью А. Коулман; Меган Шелби; Чао Лю (март 2022 г.). «Биофизическая характеристика мембранных белков, встроенных в нанодиски, с использованием корреляционной флуоресцентной спектроскопии» . Мембраны . 12 (4): 392. doi : 10.3390/membranes12040392 . ПМЦ 9028781 . ПМИД 35448362 .

[8] Ю Чен; Дж. Д. Мюллер; К.М. Берляндия; Э. Граттон (октябрь 1999 г.). «Спектроскопия флуоресцентных флуктуаций» . Методы . 19 (2): 234–52. дои : 10.1006/meth.1999.0854 . ПМИД 10527729 . S2CID 5609799 .

[Bacia_Haustein_Schwille_2-14-9] Jump up to: ^а ^б Кирстен Басия; Эльке Хаустейн; Петра Швилле (июль 2014 г.). «Флуоресцентная корреляционная спектроскопия: принципы и приложения». Протоколы Колд-Спринг-Харбора . 2014 (7): 709–25. дои : 10.1101/pdb.top081802 . ПМИД 24987147 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]